ಪೀಟರ್ ಸರ್ನೋ ಅವರಿಂದ ಸಂಪಾದಿಸಲಾಗಿದೆ, ಸ್ಟ್ಯಾನ್‌ಫೋರ್ಡ್ ಯೂನಿವರ್ಸಿಟಿ ಸ್ಕೂಲ್ ಆಫ್ ಮೆಡಿಸಿನ್, ಸ್ಟ್ಯಾನ್‌ಫೋರ್ಡ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯ, ಕ್ಯಾಲಿಫೋರ್ನಿಯಾ, ಡಿಸೆಂಬರ್ 25, 2020 ರಂದು ಅನುಮೋದಿಸಲಾಗಿದೆ (ಅಕ್ಟೋಬರ್ 25, 2020 ರಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ)
ಕೊರೊನಾವೈರಸ್-ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಲ್ಲಿ ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಾವು ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ, ಇದು ಪುನರಾವರ್ತನೆ ಮತ್ತು ವಿಕಸನೀಯ ಸಂರಕ್ಷಣೆಗೆ ಅವಶ್ಯಕವಾಗಿದೆ.nsp12 ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ NiRAN ಡೊಮೇನ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಮೊನೊಫಾಸ್ಫೇಟ್ (NMP) ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ನಾವು ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು nsp9 (ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್) ಅನ್ನು ಅದರ ಗುರಿಯಾಗಿ ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ.NiRAN Mn2+ ಅಯಾನುಗಳು ಮತ್ತು ಪಕ್ಕದ ಸಂರಕ್ಷಿತ Asn ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿತ nsp9 ಅಮೈನೊ ಟರ್ಮಿನಸ್‌ಗೆ NMP ಭಾಗದ ಕೋವೆಲನ್ಸಿಯ ಲಗತ್ತನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ.ಕರೋನವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗೆ NiRAN ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು nsp9 NMPylation ಅತ್ಯಗತ್ಯ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ.ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ವೈರಸ್‌ಗಳ ವರ್ಗದಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಾರಂಭವು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಮತ್ತು ವಿಕಸನೀಯವಾಗಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ ಎಂಬ ಊಹೆಯಲ್ಲಿನ ಹಿಂದಿನ ಅವಲೋಕನಗಳಿಗೆ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್ ಕಿಣ್ವ ಮಾರ್ಕರ್ನ ಈ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲು ಡೇಟಾ ನಮಗೆ ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, ಮತ್ತು 12 ಇತರ ಕುಟುಂಬಗಳು) RNA-ಅವಲಂಬಿತ RNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ (RdRps) ಪಾಲಿಪ್ರೊಟೀನ್‌ನಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾದ NiRAN ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ರಚನಾತ್ಮಕವಲ್ಲದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಲ್ಲಿ (N-ಟರ್ಮಿನಲ್) ಅಮೈನೊ-ಟರ್ಮಿನಲ್ (N-ಟರ್ಮಿನಲ್) ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. 1ab ವೈರಲ್ ಮುಖ್ಯ ಪ್ರೋಟೀಸ್ (Mpro) ನಿಂದ ಕೂಡಿದೆ.ಹಿಂದೆ, ಅಪಧಮನಿಯ ವೈರಸ್ NiRAN-RdRp nsp ಯ ಸ್ವಂತ GMPylation/UMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡಲಾಗಿತ್ತು ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಮೊನೊಫಾಸ್ಫೇಟ್ (NMP) ಅನ್ನು (ಪ್ರಸ್ತುತ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ) ವೈರಸ್ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಜೀವಕೋಶದ ಬಯೋಪಾಲಿಮರೀಕರಣದ ವಿಷಯಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲು ಅಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಸೃಷ್ಟಿಸಲು ಸೂಚಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು ಕರೋನವೈರಸ್ (ಹ್ಯೂಮನ್ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ [HCoV]-229E ಮತ್ತು ತೀವ್ರ ತೀವ್ರ ಉಸಿರಾಟದ ಸಿಂಡ್ರೋಮ್ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-ಅವಲಂಬಿತ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು Mpro-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ನಂತರ nsp9 ರಚನೆಯ ಮೂಲಕ nsp9 ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಫ್ಲಾಂಕಿಂಗ್ nsps ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕಲ್ ಆಗಿ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗುತ್ತದೆ, ಫಾಸ್ಫೊರಮೈಡೇಟ್ ಅನ್ನು nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್ (N3825) ಗೆ ಬಂಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಯುರಿಡಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಆದ್ಯತೆಯ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಆಗಿದೆ, ಆದರೆ ಅಡೆನೊಸಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್, ಗ್ವಾನೋಸಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಮತ್ತು ಸಿಟಿಡಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಸಹ ಸೂಕ್ತವಾದ ಸಹ-ತಲಾಧಾರಗಳಾಗಿವೆ.ಮರುಸಂಯೋಜಿತ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ nsp9 ಮತ್ತು nsp12 ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ರೂಪಾಂತರದ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಮತ್ತು ತಳೀಯವಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ HCoV-229E ಮ್ಯಟೆಂಟ್‌ಗಳು NiRAN-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ nsp9 NMPylation ಮತ್ತು ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತವೆ.ಡೇಟಾವು NiRAN ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಭವಿಷ್ಯವನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು ಮತ್ತು nsp9 N3826 ಅವಶೇಷಗಳ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು nsp9 NMPylation ಮತ್ತು ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಶೇಷವು ಸಂರಕ್ಷಿತ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ NNE ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮದ ಭಾಗವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕರೋನವೈರಸ್ ಕುಟುಂಬದಲ್ಲಿ nsp9 ಮತ್ತು ಅದರ ಹೋಮೋಲಾಗ್‌ಗಳ ಏಕೈಕ ಅಸ್ಥಿರ ಶೇಷವೆಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನವು ಇತರ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕೆ ದೃಢವಾದ ಅಡಿಪಾಯವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಂಟಿವೈರಲ್ ಔಷಧಿಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಗೆ ಸಂಭವನೀಯ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸುತ್ತದೆ.
ನಿಡೋವೈರಲ್ಸ್ ಪಾಸಿಟಿವ್-ಸ್ಟ್ರಾಂಡೆಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ವೈರಸ್ ವಿವಿಧ ಕಶೇರುಕಗಳು ಮತ್ತು ಅಕಶೇರುಕಗಳಿಗೆ ಸೋಂಕು ತರುತ್ತದೆ (1, 2).ಆದೇಶವು ಪ್ರಸ್ತುತ 14 ಕುಟುಂಬಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ (3), ಅದರಲ್ಲಿ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಕುಟುಂಬವನ್ನು ಕಳೆದ 20 ವರ್ಷಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಆ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಮೂರು ಝೂನೋಟಿಕ್ ಕರೋನವೈರಸ್ಗಳು ಪ್ರಾಣಿ ಸಂಕುಲಗಳಿಂದ ಹೊರಹೊಮ್ಮಿದವು ಮತ್ತು ಮಾನವರಲ್ಲಿ ತೀವ್ರವಾದ ಉಸಿರಾಟದ ಸೋಂಕುಗಳ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಏಕಾಏಕಿ ಉಂಟುಮಾಡಿದವು.ತೀವ್ರವಾದ ತೀವ್ರವಾದ ಸಾಂಕ್ರಾಮಿಕ ರೋಗಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ನಿರಂತರ ಸಾಂಕ್ರಾಮಿಕ ರೋಗಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ.ಉಸಿರಾಟದ ಸಿಂಡ್ರೋಮ್ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).ನಿಡೋವೈರಸ್ಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯ ಜೀನೋಮ್ ಸಂಘಟನೆಯನ್ನು ಹಂಚಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ, ಮತ್ತು ಮೆಂಬರೇನ್-ಬೌಂಡ್ ರೆಪ್ಲಿಕೇಶನ್-ಟ್ರಾನ್ಸ್ಕ್ರಿಪ್ಶನ್ ಕಾಂಪ್ಲೆಕ್ಸ್ (RTC) ನ ಉಪಘಟಕವನ್ನು 5-?²-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಎರಡು ಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವೈರಸ್ ಕಣದ ಮುಖ್ಯ ರಚನಾತ್ಮಕ ಉಪಘಟಕ, ಹಾಗೆಯೇ ಕೆಲವು ಬಿಡಿಭಾಗಗಳು .ಪ್ರೋಟೀನ್, ಜೀನೋಮ್ (1) ನ 3??² ಅಂತ್ಯದ ಮೂರನೇಯಲ್ಲಿ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಪ್ಲ್ಯಾನೇರಿಯನ್ ವೈರಸ್‌ಗಳ ಒಂದು ಕುಟುಂಬವನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ (ಮೊನೊವಿರಿಡೆ) (8), ಎಲ್ಲಾ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳು RTC ಉಪಘಟಕಗಳನ್ನು ಎರಡು ದೊಡ್ಡ ತೆರೆದ ಓದುವ ಚೌಕಟ್ಟುಗಳಲ್ಲಿ (ORF) ORF1a ಮತ್ತು ORF1b ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡುತ್ತವೆ, ಇವುಗಳನ್ನು ಜೀನೋಮಿಕ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಿಂದ ಅನುವಾದಿಸಲಾಗಿದೆ.ORF1a ಪಾಲಿಪ್ರೋಟೀನ್ (pp) 1a ಅನ್ನು ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ORF1a ಮತ್ತು ORF1b ಜಂಟಿಯಾಗಿ pp1ab ಅನ್ನು ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ORF1a ನಿಂದ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಮುಖ್ಯ ಪ್ರೋಟೀಸ್ (Mpro) ನ ಸಾಮಾನ್ಯ ಭಾಗವಹಿಸುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ, pp1a ಮತ್ತು pp1ab ಎರಡನ್ನೂ ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕಲ್ ಆಗಿ ವಿವಿಧ ರಚನಾತ್ಮಕವಲ್ಲದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಾಗಿ (nsps) ಸಂಸ್ಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು 3CLpro ಎಂದೂ ಕರೆಯುತ್ತಾರೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಇದು ಪಿಕಾರ್ನವೈರಸ್‌ನ 3Cpro ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಮಾಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ( 9)ಈ ಎನ್‌ಎಸ್‌ಪಿಎಸ್‌ಗಳನ್ನು ದೊಡ್ಡ ಡೈನಾಮಿಕ್ ಆರ್‌ಟಿಸಿಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಭಾವಿಸಲಾಗಿದೆ, ಜೀನೋಮಿಕ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಪ್ರತಿಕೃತಿ) ಮತ್ತು ಸಬ್ಜೆನೊಮಿಕ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ (ಪ್ರತಿಲೇಖನ) ದ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಓಆರ್‌ಎಫ್ 1 ಬಿ (10? ? ?12).
ಕೋರ್ RTC RNA-ಅವಲಂಬಿತ RNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ (RdRp) (13), ಸೂಪರ್‌ಫ್ಯಾಮಿಲಿ 1 ಹೆಲಿಕೇಸ್ (HEL1) (14, 15) ಮತ್ತು ಹಲವಾರು RNA ಸಂಸ್ಕರಣಾ ಕಿಣ್ವಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಇವುಗಳನ್ನು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ORF1b ಮತ್ತು ಕರೋನವೈರಸ್ ಕುಟುಂಬದಲ್ಲಿ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಇದು nsp12-nsp16 ಮತ್ತು ಆರ್ಟೆರಿಯೊವೈರಿಡೆ ಕುಟುಂಬದಲ್ಲಿ nsp9-nsp12 (ಉಲ್ಲೇಖ 10ââ 12 ನೋಡಿ).RdRp ಮತ್ತು HEL1 ಪಕ್ಷಿಗಳ ಗೂಡಿನ ವೈರಸ್‌ನ ಎರಡು (ಐದನೇ ಒಂದು) ಸಂರಕ್ಷಿತ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಇತರ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ವೈರಸ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಹೋಮಾಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.pp1a ನ ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಲ್ (C-ಟರ್ಮಿನಲ್) ಪ್ರದೇಶದಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆಯಾದ ಹಲವಾರು ಸಣ್ಣ nsps ಸೇರಿದಂತೆ ಇತರ ಉಪಘಟಕಗಳಿಂದ ಕೋರ್ ರೆಪ್ಲಿಕೇಸ್ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಂಬಲಾಗಿದೆ, Mpro ನ ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ (ಕ್ರಮವಾಗಿ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ nsp5 ಮತ್ತು ಅಪಧಮನಿಯ ವೈರಸ್ nsp4).ಅವರು ಸೀಮಿತ ಕುಟುಂಬ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ರಕ್ಷಣೆ ಮತ್ತು ವೈವಿಧ್ಯಮಯ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದಾರೆ (ಉಲ್ಲೇಖ 10ââ12 ರಲ್ಲಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ).
ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಎಲ್ಲಾ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ RdRp ಪಕ್ಕದಲ್ಲಿರುವ ಅಮಿನೊ ಟರ್ಮಿನಸ್ (N-ಟರ್ಮಿನಸ್) ನಲ್ಲಿ ವಿಶಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮ ಮೋಟಿಫ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಡೊಮೇನ್ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ, ಆದರೆ ಯಾವುದೇ ಇತರ RNA ವೈರಸ್‌ಗಳಿಲ್ಲ (16).ಅದರ ಸ್ಥಳ ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ವರ್ಗಾವಣೆ (ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಮೊನೊಫಾಸ್ಫೇಟ್ [NMP] ವರ್ಗಾವಣೆ) ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ಈ ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು NiRAN (Nestvirus RdRp- ಸಂಬಂಧಿತ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ವರ್ಗಾವಣೆ) ಎಂದು ಹೆಸರಿಸಲಾಗಿದೆ.NiRAN-RdRp ಯ ಡ್ಯುಯಲ್-ಡೊಮೇನ್ ಸಂಯೋಜನೆಯು ಕೊರೊನಾವೈರಿಡೆ ಕುಟುಂಬದಲ್ಲಿ nsp12 ಮತ್ತು ಆರ್ಟೆರಿಯೊವೈರಿಡೆ ಕುಟುಂಬದಲ್ಲಿ nsp9 ಮತ್ತು ಇತರ ನೆಸ್ಟೊವಿರಿಡೆಗಳಲ್ಲಿ, NiRAN-RdRp ವೈರಲ್ ಪಾಲಿಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಿಂದ ಸ್ವತಂತ್ರ nsp ಆಗಿ ಬಿಡುಗಡೆಯಾಗುವ ನಿರೀಕ್ಷೆಯಿದೆ.ಕೊರೊನಾವೈರಸ್‌ನಲ್ಲಿ, NiRAN ಡೊಮೇನ್ ??1/450 ಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು ಲಿಂಕರ್ ಪ್ರದೇಶದ ಮೂಲಕ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ RdRp ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಸಂಪರ್ಕ ಹೊಂದಿದೆ (16.19).ಎಕ್ವೈನ್ ಆರ್ಟೆರಿಟಿಸ್ ವೈರಸ್ (ಇಎವಿ) (ಆರ್ಟೆರಿವಿರಿಡೆ) ನಲ್ಲಿ, ಮರುಸಂಯೋಜಕ nsp9 Mn2+ ಅಯಾನ್-ಅವಲಂಬಿತ (ಸ್ವಯಂ) UMPylation ಮತ್ತು GMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ನೆಸ್ಟೋವೈರಸ್, AN, BN ಮತ್ತು CN ನಲ್ಲಿನ ಮೂರು ಸಂರಕ್ಷಿತ ಅನುಕ್ರಮ ಬೇಸ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿದೆ.ಅಲ್ಲಿ N ಎಂದರೆ NiRAN) (16).ಈ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪಾರ್ಶ್ವವು ಕಡಿಮೆ ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಮೋಟಿಫ್ ಪ್ರಿಎಎನ್ ಆಗಿದೆ.ಈ ಶೇಷಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ದೂರದ ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ, ಅಲ್ಲಿ ಅವು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ (NTP) ಬಂಧಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ವೇಗವರ್ಧಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ (20, 21) ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ವೀಕ್ಷಣೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಸ್ಯೂಡೋಮೊನಾಸ್ ಸಿರಿಂಗೇಯಿಂದ ಸ್ಯೂಡೋಕಿನೇಸ್ SelO ನಲ್ಲಿನ ಹಲವಾರು ಪ್ರಮುಖ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಪ್ರಕಟಿಸಿದ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ಸೂಪರ್‌ಕಾಂಪ್ಲೆಕ್ಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಜೋಡಿಸಬಹುದು.ಸಂರಕ್ಷಿತ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ NiRAN ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಟ್ರಕ್ಚರ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ (17).ದಾಖಲಿತ (ಸ್ವಯಂ) U/GMPylation NMP ಅನ್ನು (ಪ್ರಸ್ತುತ ತಿಳಿದಿಲ್ಲ) ತಲಾಧಾರಕ್ಕೆ (16) ವರ್ಗಾಯಿಸಲು ಅಸ್ಥಿರ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು NiRAN ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್ ನಡುವಿನ ರಚನಾತ್ಮಕ ಹೋಲಿಕೆ (17, 19) ) ಇದು ಊಹೆ NiRAN ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾರ್ಪಡಿಸುತ್ತದೆ.
ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಅದರ ವಿಶಿಷ್ಟ ಮತ್ತು ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ವ್ಯವಸ್ಥಿತ ಸಂಬಂಧ ಮತ್ತು RdRp ನಿಂದ ಆನುವಂಶಿಕ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಸೇರಿದಂತೆ ಹಲವು ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳು, NiRAN ಅನ್ನು ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಮಂಜಸವಾದ ಪ್ರಮುಖ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಿಣ್ವವನ್ನಾಗಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದು ಅವುಗಳ ಹೊರಹೊಮ್ಮುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಗುರುತಿಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ.ಹಿಂದೆ, ಜೀನೋಮ್/ಸಬ್ಜೆನೋಮಿಕ್ ಅನುವಾದ ಅಥವಾ ಪ್ರತಿಕೃತಿ/ಪ್ರತಿಲೇಖನವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು NiRAN ಒಳಗೊಂಡ ಮೂರು ಸಂಭಾವ್ಯ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು.ಆ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ ವಿರಳ ಮತ್ತು ಅಪೂರ್ಣ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸುವಾಗ, ಪ್ರತಿ ಕಾರ್ಯವು ಅದರ ಅನುಕೂಲಗಳು ಮತ್ತು ಅನಾನುಕೂಲಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (16).ಈ ಸಂಶೋಧನೆಯಲ್ಲಿ, ಎರಡು ಕುಲಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಕರೋನವೈರಸ್ಗಳ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಜೆನೆಟಿಕ್ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಗುರಿಯನ್ನು ನಾವು ಹೊಂದಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಈ ನಿಗೂಢ ಸಾಮ್ರಾಜ್ಯದ ಒಳನೋಟವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳನ್ನು ಕರೋನವೈರಸ್ ಕುಟುಂಬದ ನೈಸರ್ಗಿಕ ರೂಪಾಂತರದ ವಿಕಸನೀಯ ಹಿನ್ನೆಲೆಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿದ್ದೇವೆ.RTC ಯಲ್ಲಿ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಮೂಲಕ NiRAN ನ ತಿಳುವಳಿಕೆಯಲ್ಲಿನ ಪ್ರಮುಖ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ನಾವು ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ, ಇದು (ಲಭ್ಯವಿರುವ ಮೂರು ಊಹೆಗಳಲ್ಲಿ) ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್ RNA ಯ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುವಲ್ಲಿ ಈ ಡೊಮೇನ್‌ನ ಪಾತ್ರಕ್ಕೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ.ಈ ಸಂಶೋಧನೆಯು ವೈರಸ್ ಹೋಸ್ಟ್ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ NiRAN ನ ಇತರ ಪಾತ್ರಗಳ ಸಾಧ್ಯತೆಗಳನ್ನು ತೆರೆಯುತ್ತದೆ.
ಕರೋನಾ ವೈರಸ್ nsp12-ಸಂಬಂಧಿತ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನ ಎಂಜೈಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು, ನಾವು C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ His6 ಟ್ಯಾಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ E. ಕೊಲಿಯಲ್ಲಿ ಮಾನವ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ 229E (HCoV-229E) nsp12 ನ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ರೂಪವನ್ನು ತಯಾರಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಸಂಯೋಜಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮೆಟೀರಿಯಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ಮೆಥಡ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ MnCl2 ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ [α32-P ] ಜೊತೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಜೊತೆಗೆ NTP ಯೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಿ.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಉತ್ಪನ್ನದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು nsp12 (106 kDa) ನೊಂದಿಗೆ ರೇಡಿಯೊಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (106 kDa), ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ nsp12 ಕೋವೆಲೆಂಟ್ ಪ್ರೊಟೀನ್-NMP ವ್ಯಸನಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಯೂರಿಡಿನ್ ಮೊನೊಫಾಸ್ಫೇಟ್ (UMP) (ಚಿತ್ರ 1A) ಮತ್ತು ಬಿ)ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಇತರ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, UMP ಸಂಯೋಜನೆಯ ಸಂಕೇತದ ತೀವ್ರತೆಯು 2 ರಿಂದ 3 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 1C).ಈ ಡೇಟಾವು ಕರೋನವೈರಸ್ (16) ನ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನ ಊಹಿಸಲಾದ NMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಕರೋನವೈರಸ್ ಮತ್ತು ಅಪಧಮನಿಯ ವೈರಸ್‌ನ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಆದ್ಯತೆಗಳು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
HCoV-229E nsp12 ನ ಸ್ವಯಂ-NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆ.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ಅನ್ನು ಗೊತ್ತುಪಡಿಸಿದ [α-32P] NTP ಯೊಂದಿಗೆ 6 mM MnCl2 ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗಿದೆ (ವಿವರಗಳಿಗಾಗಿ ಮೆಟೀರಿಯಲ್ಸ್ ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ).ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು SDS-PAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಅದ್ಭುತ ನೀಲಿ ಬಣ್ಣದಿಂದ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ.(ಬಿ) ರೇಡಿಯೊಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಫಾಸ್ಫರಸ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಮೂಲಕ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.nsp12-His6 ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಮಾಸ್ ಮಾರ್ಕರ್‌ಗಳ ಸ್ಥಾನಗಳು (ಕಿಲೋಡಾಲ್ಟನ್ಗಳಲ್ಲಿ) A ಮತ್ತು B. (C) ನಲ್ಲಿ ವಿಕಿರಣಶೀಲ ಸಂಕೇತದ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು (ಸರಾಸರಿ ± SEM) ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗಿದೆ.*P≤0.05.ಸಿಗ್ನಲ್ ಶಕ್ತಿ (ಶೇಕಡಾವಾರು) ಯುಟಿಪಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ.
ಜೀವಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ (16) EAV ಮತ್ತು SARS-CoV ನ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗೆ NiRAN-ಸಂಬಂಧಿತ ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳು ಅವಶ್ಯಕವೆಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆಯಾದರೂ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ NiRAN ಕಾರ್ಯ ಮತ್ತು ಸಂಭಾವ್ಯ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಇನ್ನೂ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ.NiRAN ಮತ್ತು ಪ್ರೊಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್ ತರಹದ ಮಡಿಕೆಗಳನ್ನು (17, 22) ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಕುಟುಂಬದ ನಡುವೆ ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ವರದಿಯಾದ ರಚನಾತ್ಮಕ ಹೋಲಿಕೆಯು NiRAN ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ NMPylation ಅನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಊಹೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ನಮ್ಮನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು.ನಾವು HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) ಮೂಲಕ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ರಚನಾತ್ಮಕವಲ್ಲದ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಸಂಭಾವ್ಯ ಏಕರೂಪದ ಗುರಿಗಳ ಗುಂಪನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ His6 ಟ್ಯಾಗ್ (SI ಅನುಬಂಧ, ಟೇಬಲ್ S1) , ಮತ್ತು ಈ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು [α32-P] ಯುರಿಡಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ ([α32-P]UTP) ಯೊಂದಿಗೆ nsp12 ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಿ.E. ಕೊಲಿಯಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಬೋವಿನ್ ಸೀರಮ್ ಅಲ್ಬುಮಿನ್ ಮತ್ತು MBP-LacZα ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2A, ಲೇನ್‌ಗಳು 1 ರಿಂದ 7).ರೇಡಿಯೊಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅನ್ನು ಸೋಡಿಯಂ ಡೋಡೆಸಿಲ್ ಸಲ್ಫೇಟ್-ಪಾಲಿಅಕ್ರಿಲಮೈಡ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ (SDS-PAGE) ಮತ್ತು ಆಟೋರಾಡಿಯೋಗ್ರಫಿ ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು nsp12 ಮತ್ತು nsp9 ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ವಿಕಿರಣಶೀಲ ಸಂಕೇತವಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ.ಸಂಕೇತದ ಸ್ಥಾನವು nsp9 ನ ಆಣ್ವಿಕ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ, ಇದು nsp9 ನ nsp12-ಮಧ್ಯಸ್ಥ UMPylation ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2B, ಟ್ರ್ಯಾಕ್ 7).ಬೇರೆ ಯಾವುದೇ ಪರೀಕ್ಷಾ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು UMPylated ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ, ಇದು nsp9 nsp12 ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ತಲಾಧಾರವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೀರ್ಮಾನಿಸಲು ನಮಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು.ಚಿತ್ರ 1 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಸ್ವಯಂ-NMPylation ಡೇಟಾಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, nsp12 ಎಲ್ಲಾ ನಾಲ್ಕು NMP ಗಳನ್ನು nsp9 ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ ದಕ್ಷತೆಯು ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ, UMP> ಅಡೆನೊಸಿನ್ ಮೊನೊಫಾಸ್ಫೇಟ್ (AMP)> ಗ್ವಾನೊಸಿನ್ ಮೊನೊಫಾಸ್ಫೇಟ್ (GMP)> ಸೈಟಿಡಿನ್ ಮೊನೊಫಾಸ್ಫೇಟ್ (CMP) ) ( ಚಿತ್ರ).3 ಎ ಮತ್ತು ಬಿ).ಈ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ (ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮತ್ತು ಮಾನ್ಯತೆ ಸಮಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ, nsp12 ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ; ವಸ್ತುಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳು), nsp12 ನ ಸ್ವಯಂ-NMPylation ಅನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಗಲಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 2B, ಲೇನ್ 7, ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ 1B ಅನ್ನು ಹೋಲಿಕೆ ಮಾಡಿ). ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ (ಮತ್ತು ಬಹು ಸುತ್ತುಗಳು) UMP ಅನ್ನು nsp12 ನಿಂದ nsp9 ಗೆ ಸ್ಥಳಾಂತರಿಸಲಾಯಿತು.UMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಚಿತ್ರ 3C ಯಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ Mn2+ ಅಯಾನುಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ Mg2+ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ UMP ವರ್ಗಾವಣೆಯ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಮಾತ್ರ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಇತರ ಎರಡು ಡೈವಲೆಂಟ್ ಕ್ಯಾಟಯಾನುಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಲ್ಲ.ಸೈಟಿಡಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ (CTP), ಗ್ವಾನೋಸಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ (GTP), ಮತ್ತು ಅಡೆನೊಸಿನ್ ಟ್ರೈಫಾಸ್ಫೇಟ್ (ATP) (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S1) ಹೊಂದಿರುವ NMPylation ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.
nsp9 ನ HCoV-229E nsp12-ಮಧ್ಯಸ್ಥ UMPylation.HCoV-229E nsp12-Hmediated ನ UMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ಪ್ರೋಟೀನ್ ತಲಾಧಾರಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು (ಬೋವಿನ್ ಸೀರಮ್ ಅಲ್ಬುಮಿನ್, MBP-lacZα, ಮತ್ತು HCoV-229E nsps ಸರಣಿಯನ್ನು ORF1a ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಿದ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ His6 ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ) ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರೋಟೀನ್.ವಸ್ತುಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ nsp12 ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ (A) ಅಥವಾ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ (B) 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ [α-32P] UTP ಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಿ.A ಮತ್ತು B ನ ಮೇಲ್ಭಾಗದಲ್ಲಿ, Coomassie ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ ಬಣ್ಣದೊಂದಿಗೆ SDS- ಪಾಲಿಯಾಕ್ರಿಲಮೈಡ್ ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು A ಮತ್ತು B ನ ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ, ಅನುಗುಣವಾದ ಆಟೋರಾಡಿಯೋಗ್ರಾಮ್ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರೋಟೀನ್ ಆಣ್ವಿಕ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ ಮಾರ್ಕರ್ನ ಸ್ಥಾನವನ್ನು (ಕಿಲೋಡಾಲ್ಟನ್ಗಳಲ್ಲಿ) ಎಡಭಾಗದಲ್ಲಿ ನೀಡಲಾಗಿದೆ.nsp12-His6 (B, ಟಾಪ್) ನ ಸ್ಥಾನ ಮತ್ತು nsp9-His6 (B, ಲೇನ್ 7) ನೊಂದಿಗೆ nsp12-His6 ನ ಕಾವು ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾದ ವಿಕಿರಣಶೀಲ ಸಿಗ್ನಲ್ ಅನ್ನು ಸಹ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು [α-32P]UMP ಗೆ nsp9-His6 ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (12.9 kDa), ಇದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ.
HCoV-229E NiRAN-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಮತ್ತು nsp9 NMPylation ನ ವೈರಲಾಜಿಕಲ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣ.(A ಮತ್ತು B) ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಸಹ-ತಲಾಧಾರದ ಪಾತ್ರ.Nsp12-His6 ಮತ್ತು nsp9-His6 ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ NMPylation ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನ [α-32P] NTP ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.(A, ಟಾಪ್) ಕೂಮಾಸ್ಸಿ-ಸ್ಟೇನ್ಡ್ nsp9-His6 ಅನ್ನು SDS-PAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.(ಎ, ಕೆಳಭಾಗ) ಜೆಲ್ನ ಅದೇ ಪ್ರದೇಶದ ಆಟೋರಾಡಿಯೋಗ್ರಾಫ್.(B) ಗೊತ್ತುಪಡಿಸಿದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಕೊಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಬಂಧಿತ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು (ಸರಾಸರಿ ± SEM) ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.*P≤0.05.(ಸಿ) ಲೋಹದ ಅಯಾನುಗಳ ಪಾತ್ರ.[α-32P] UTP ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಲೋಹದ ಅಯಾನುಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಮಾಣಿತ NMPylation ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ 1 mM ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ.C ನಲ್ಲಿ, ಮೇಲ್ಭಾಗದಲ್ಲಿ, Coomassie ಸ್ಟೇನ್ಡ್ nsp9-His6 ಅನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು C ನಲ್ಲಿ, ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ, ಅನುಗುಣವಾದ ಆಟೋರಾಡಿಯೋಗ್ರಫಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಗಾತ್ರವನ್ನು (ಕಿಲೋಡಾಲ್ಟನ್ಗಳಲ್ಲಿ) A ಮತ್ತು C ಯ ಎಡಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. (D) HCoV-229E nsp12-His6 ಯ ರೂಪಾಂತರಿತ ರೂಪವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಪರ್ಯಾಯವನ್ನು [α-32P]ಯುಟಿಪಿಯಲ್ಲಿ ಹೊಂದಿದೆ, ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ವಸ್ತುಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ.NMPylation ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ರೇಡಿಯೊಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ nsp9-His6 ಅನ್ನು ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಷನ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ (D, ಟಾಪ್) ಮೂಲಕ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (wt) ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು D ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಕೆಳಭಾಗವನ್ನು ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಸರಾಸರಿ (± SEM) ಎಂದು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಸಂರಕ್ಷಿತವಲ್ಲದ ಅವಶೇಷಗಳ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.(ಇ) ಸೋಂಕು ತಗುಲಿದ 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಪಡೆದ p1 ಜೀವಕೋಶಗಳ ಕಲ್ಚರ್ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ವೈರಸ್ ಟೈಟರ್ ಅನ್ನು ಪ್ಲೇಕ್ ಅಸ್ಸೇ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇಂಜಿನಿಯರ್ ಮಾಡಲಾದ HCoV-229E ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ನ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಕೋಡಾನ್ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸಲಾಗಿದೆ (ಅಶೇಷ ಸಂಖ್ಯೆಯು pp1ab ನಲ್ಲಿ ಅವರ ಸ್ಥಾನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ).ಪ್ರತಿಕೃತಿ-ಕೊರತೆಯ RdRp ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ರೂಪಾಂತರಿತ nsp12_DD4823/4AA ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.
NiRAN ನ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್‌ನ ಆಳವಾದ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಮತ್ತು nsp9-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ NMP ವರ್ಗಾವಣೆಯ ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ನಾವು ರೂಪಾಂತರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ನಾವು NiRAN AN, BN ಮತ್ತು CN ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಿದ್ದೇವೆ ( 16) ಇದು ಅಲಾ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S2).ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ Arg-to-Lys ಅಥವಾ Lys-to-Arg ಪರ್ಯಾಯಗಳ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ಎರಡು ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಯಿತು.(ಋಣಾತ್ಮಕ) ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ, ಕರೋನವೈರಸ್ಗಳು ಮತ್ತು ಇತರ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸದ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಇರುವ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಅಲಾದಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. BN) ಮತ್ತು D4280A (CN) nsp12 ಮೂಲಕ nsp9 NMPylation ಅನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಬದಲಿ (R4178K) , K4116R) ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ತಮ್ಮ ಚಟುವಟಿಕೆಯ 60% ಮತ್ತು 80% ಅನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ, ಇದು ಆಯಾ ಬದಿಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ಬಂಧಗಳ ಸಡಿಲಿಕೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಸರಪಳಿಗಳು ಭೌತ ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3D).ಹಲವಾರು ಇತರ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು E4145A, D4273A, F4281A ಮತ್ತು D4283A ಅನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುವುದು ಕಡಿಮೆ ಹಾನಿಕಾರಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು nsp9 UMPylation ಕೇವಲ ಮಧ್ಯಮವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ.ಇತರ NTP ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ nsp9 NMPylation ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3D ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S3), ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಪರ್ಯಾಯಗಳ ಮೇಲೆ ಗಮನಿಸಿದ ಪರಿಣಾಮಗಳು ಬಳಸಿದ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಸಹ-ತಲಾಧಾರದ ಪ್ರಕಾರದಿಂದ ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿವೆ ಎಂದು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತದೆ.ಮುಂದೆ, ಸೆಲ್ ಕಲ್ಚರ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರೋನವೈರಸ್ಗಳ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯ ಮೇಲೆ ಈ ಎನ್‌ಎಸ್‌ಪಿ 12 ಪರ್ಯಾಯಗಳ ಸಂಭವನೀಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ನಾವು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ, ನಾವು 5 -7 ಕೋಶಗಳನ್ನು ಲಿಪ್ಯಂತರ ಮಾಡಲು ಮರುಸಂಯೋಜಿತ ವ್ಯಾಕ್ಸಿನಿಯಾ ವೈರಸ್ (23, 24) ನಲ್ಲಿ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾದ ಸೂಕ್ತವಾದ ತಳೀಯವಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ಪೂರಕ DNA (cDNA) ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಸಾಂಕ್ರಾಮಿಕ ವೈರಸ್ ಸಂತತಿಯ ಟೈಟರೇಶನ್ ಹೆಚ್ಚಿನ HCoV-229E NiRAN ರೂಪಾಂತರಿತ ರೂಪಗಳು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3E).ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಲ್ಲದ ವೈರಲ್ ಮ್ಯಟೆಂಟ್‌ಗಳ ಗುಂಪು ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ NMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಅಥವಾ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ಆದರೆ ಎರಡು ಇತರ ಪರ್ಯಾಯಗಳಿವೆ (K4116R, E41045A) % ಕಾಯ್ದಿರಿಸಲಾಗಿದೆಯೇ?ಅವರ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ನಿರ್ಬಂಧಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಅದೇ ರೀತಿ, NiRAN ನ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಮಧ್ಯಮ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾದ ಎರಡು ಇತರ ರೂಪಾಂತರಗಳು (R4178K, F4281A) ಲೈವ್ ವೈರಸ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಿದವು, ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ವೈರಸ್‌ಗಳು ಪುನರಾವರ್ತನೆಯ ಮೂಲಕ ಟೈಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತವೆ.ಚಿತ್ರ 3D ಯಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ದತ್ತಾಂಶಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಕರೋನವೈರಸ್ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಇತರ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) ಸಂರಕ್ಷಿಸದ ಇತರ ನಾಲ್ಕು ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಬದಲಿಸಿ (8, 16) ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಾದ ವೈರಸ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ ಸಂತತಿ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ ವೈರಸ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಮಧ್ಯಮ ಕಡಿಮೆಯಾದ ಟೈಟರ್ (ಚಿತ್ರ 3E).
NiRAN-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ NMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಸಕ್ರಿಯ RdRp ಡೊಮೇನ್‌ನ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, RdRp ಮೋಟಿಫ್ C ಯಲ್ಲಿನ ಡೈವಲೆಂಟ್ ಮೆಟಲ್ ಅಯಾನುಗಳ (11) ಸಮನ್ವಯದಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಎರಡು ಸಂರಕ್ಷಿತ Asp ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು Ala ನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ nsp12_DD4823/4AA ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಅದರ nsp9 NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆ, nsp12-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ in vitro nsp9 NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಅಗತ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S4).
nsp12 ಗಾಗಿ nsp9-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ NMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಿದ ನಂತರ, ನಾವು NMP-nsp9 ಅಡಕ್ಟ್ ಅನ್ನು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (MS) ಮೂಲಕ ನಿರೂಪಿಸಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಮರುಸಂಯೋಜಕ HCoV-229E nsp9 ನ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ 12,045 Da (ಚಿತ್ರ 4A) ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಮಟ್ಟವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.nsp12 ನ ಸೇರ್ಪಡೆಯು nsp9 ನ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಿಲ್ಲ, nsp12 ಮತ್ತು nsp9 ಬಳಸಿದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ (ಡಿನಾಟರೇಶನ್) ಸ್ಥಿರ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ರೂಪಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4A).UTP ಮತ್ತು GTP ಯ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, nsp9 ಮತ್ತು nsp12 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯ ಮಾಪನವು ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ UTP ಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯು 306 Da ಚಲಿಸಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ ಮತ್ತು GTP ಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯು 345 Da ಚಲಿಸಿತು, ಇದು ಪ್ರತಿ nsp9 ಅಣುವು UMP ಅಥವಾ GMP ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. (ಚಿತ್ರ 4) ಸಿ ಮತ್ತು ಡಿ).NiRAN-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ nsp9 NMPylation ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಶಕ್ತಿಯು NTP ಜಲವಿಚ್ಛೇದನೆ ಮತ್ತು ಪೈರೋಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಿಡುಗಡೆಯಿಂದ ಬರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ nsp12 (ಕಿಣ್ವ) ಗಿಂತ 10-ಪಟ್ಟು ಮೋಲಾರ್ ಹೆಚ್ಚುವರಿ nsp9 (ಗುರಿ) ಬಳಸಲಾಗಿದ್ದರೂ, nsp9 ನ ಬಹುತೇಕ ಸಂಪೂರ್ಣ NMPylation ಅನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು, nsp12 ಮತ್ತು nsp9 ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಅಲ್ಪಕಾಲಿಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು nsp12 ಹೆಚ್ಚು nsp9 ಅನ್ನು NMPylate ಮಾಡಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಅಣು.
nsp12 ಮತ್ತು UTP ಅಥವಾ GTP ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ nsp9 ನ ಏಕ NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI ಅನುಬಂಧ, ಟೇಬಲ್ S1) (AD) ನ ಡಿಕನ್ವಾಲ್ಯೂಟ್ ಮಾಡಲಾದ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.(A) nsp9 ಮಾತ್ರ, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ.
nsp12 ನಿಂದ UMPylated nsp9 ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, nsp9-UMP ಅನ್ನು ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸೀಳಲಾಯಿತು.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ನ್ಯಾನೊ-ಹೈ ಪರ್ಫಾರ್ಮೆನ್ಸ್ ಲಿಕ್ವಿಡ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (HPLC) ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಆನ್‌ಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಟಂಡೆಮ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೆಟ್ರಿ (MS/MS) ಮೂಲಕ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಬಯೋನಿಕ್ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ (ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮೆಟ್ರಿಕ್ಸ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅಮಿನೋ ಆಮ್ಲದ UMPylation ಅನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.ಇದನ್ನು ಕೈಯಾರೆ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪೂರ್ವಗಾಮಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ [UMP]NNEIMPGK ನ ಟಂಡೆಮ್ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S5A) 421 m/z ನಲ್ಲಿ ಒಂದು ತುಣುಕನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಇದು nsp9 ನ ಶೇಷ 1 ಗೆ UMP ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ, Asn ಅನ್ನು Orthocoronavirinae ಸದಸ್ಯರ ನಡುವೆ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S6).N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್ ಸಾರಜನಕವು UMP ಯನ್ನು ಸ್ವೀಕರಿಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಂಬಿದ್ದರೂ, N-ಟರ್ಮಿನಲ್‌ನಲ್ಲಿ NMP ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಕಾರಣಕ್ಕಾಗಿ, HPLC ಯಿಂದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ NMPylated ಮತ್ತು NMPylated N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ nsp9 ಅನ್ನು ಅಸಿಟೋನ್ ಮತ್ತು ಸೋಡಿಯಂ ಸೈನೊಬೊರೊಹೈಡ್ರೈಡ್ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಈ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರೊಪೈಲ್ (25) ನೊಂದಿಗೆ ಉಚಿತ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದು.NNEIMPGK ಅನುಕ್ರಮದೊಂದಿಗೆ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ nsp9-ಪಡೆದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಎರಡು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, ಒಂದು Asn ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ Lys ನ ಅಡ್ಡ ಸರಪಳಿಯಲ್ಲಿ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಎರಡೂ ತುದಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೊಪೈಲ್ ಗುಂಪುಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಬಹುದು.NMPylated ಅಲ್ಲದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ಅಯಾನ್ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳನ್ನು SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S5B ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಮತ್ತು C-ಟರ್ಮಿನಲ್ (ಮೊನೊ)ಪ್ರೊಪಿಲೇಟೆಡ್ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S5B, ಮೇಲಿನ ಲೇನ್) ಮತ್ತು ಡಿಪ್ರೊಪಿಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S5B, ಕೆಳಗಿನ ಲೇನ್) ಗುರುತಿಸಬಹುದು.nsp9 ನ NMPylated N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಬಳಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಈ ಮಾದರಿಯು ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರೊಪೈಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಗುರುತಿಸಬಹುದು, ಆದರೆ ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರೊಪಿಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಡಿಪ್ರೊಪಿಲೇಟೆಡ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S5C), ಇದನ್ನು ತಡೆಯಲು UMP ಅನ್ನು N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್‌ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಮಾಡುವ ಗುಂಪು.
ಮುಂದೆ, ಗುರಿ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ನಿರ್ಬಂಧಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲು nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ನಾವು (Ala ಅಥವಾ Ser ನೊಂದಿಗೆ) ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತೇವೆ ಅಥವಾ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಅಳಿಸುತ್ತೇವೆ.NSP9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಶೇಷದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ NiRAN nsp9-NMP ಅಡಕ್ಟ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುವ ನಮ್ಮ MS ಡೇಟಾದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, nsp9 NMPylation ಗೆ nsp9 N- ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲು ವೈರಲ್ ಮಾಸ್ಟರ್ ಪ್ರೋಟೀಸ್ (Mpro, nsp5) ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಅದರ ಪಾಲಿಪ್ರೋಟೀನ್ ಪೂರ್ವಗಾಮಿ.ಈ ಊಹೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು E. ಕೊಲಿಯಲ್ಲಿ nsp9 ಹೊಂದಿರುವ ಪೂರ್ವಗಾಮಿ ಪ್ರೊಟೀನ್ nsp7-11 ಅನ್ನು ತಯಾರಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು [α-32P] UTP (ವಸ್ತುಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳು) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಮಾಣಿತ NMPylation ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ.ಚಿತ್ರ 5A (ಲೇನ್ 3) ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, ಕತ್ತರಿಸದ nsp7-11 ಪೂರ್ವಗಾಮಿ nsp12 ನೊಂದಿಗೆ ರೇಡಿಯೊಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿಲ್ಲ.ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಪೂರ್ವಗಾಮಿಯಿಂದ nsp9 (ಮತ್ತು ಇತರ nsps) ಅನ್ನು ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲು nsp7-11 ಅನ್ನು ಮರುಸಂಯೋಜಕ nsp5 ನಿಂದ ಸೀಳಿದರೆ, nsp9 ನೊಂದಿಗೆ ವಲಸೆ ಹೋಗುವ ರೇಡಿಯೊಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪತ್ತೆಯಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ನಮ್ಮ ತೀರ್ಮಾನವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ NiRAN ಮತ್ತು N- ಕೋವೆಲೆಂಟ್ nsp9-NMP ವ್ಯಸನದ ಆಯ್ದ ರಚನೆ .N-ಟರ್ಮಿನಲ್ Asn ನ ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್ (pp1a/pp1ab ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಾನ 3825).ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ nsp9 ಕನ್ಸ್ಟ್ರಕ್ಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಈ ತೀರ್ಮಾನವನ್ನು ಸಹ ಬೆಂಬಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಎರಡೂ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, nsp9 ನ NiRAN-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ UMPylation ಅನ್ನು ರದ್ದುಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S7).ಮುಂದೆ, ನಾವು nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಲ್‌ನಲ್ಲಿ 3825-NNEIMPK-3832 ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ಅಳಿಸಲಾದ ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು Asn ಶೇಷಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ತಯಾರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಎರಡೂ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, nsp9 UMPylation ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5B), ನೈಜ nsp9 N-ಟರ್ಮಿನಸ್ NMP ಗ್ರಾಹಕವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.
nsp9 ನ ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕ್ ಸಂಸ್ಕರಣೆ ಮತ್ತು nsp12-ಮಧ್ಯಸ್ಥ UMPylation ನಲ್ಲಿ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಪಾತ್ರ.(A) nsp9 UMPylation ಗೆ ಉಚಿತ nsp9 N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.Nsp7-11-His6 ಯುಟಿಪಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ NMPylation ಪತ್ತೆ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 30 °C ನಲ್ಲಿ ಪೂರ್ವ-ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟೆಡ್ ಆಗಿದೆ ಮರುಸಂಯೋಜಕ Mpro (nsp5-His6) ಉಪಸ್ಥಿತಿ ಅಥವಾ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ.3 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಸಾಮಗ್ರಿಗಳು ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ nsp12-His6 ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ NMPylation ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ.nsp5-His6 (ಲೇನ್ 1) ಮತ್ತು nsp9-His6 (ಲೇನ್ 2) ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.10 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಕೊನೆಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು SDS-PAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ (ಎ, ಟಾಪ್) ನೊಂದಿಗೆ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ.Nsp7-11-His6 ಪೂರ್ವಗಾಮಿ ಮತ್ತು nsp5-His6 ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಸೀಳಿನಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಬಲಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ದಯವಿಟ್ಟು ಗಮನಿಸಿ (ಅವುಗಳ ಸಣ್ಣ ಗಾತ್ರದ ಕಾರಣ) ಈ ಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿ nsp7 ಮತ್ತು nsp11-His6 ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು nsp5-His6 ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ (ಲೇನ್‌ಗಳು 1 ಮತ್ತು 4; nsp5-His6 ನ ಸ್ಥಾನವನ್ನು ಘನ ವೃತ್ತದಿಂದ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) ಅಥವಾ nsp9-His6 (ಲೇನ್ 2) ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ MBP (ತೆರೆದ ವಲಯಗಳಿಂದ ಸೂಚಿಸಲಾಗಿದೆ) ಉಳಿದಿರುವ ಕಲ್ಮಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಅವುಗಳನ್ನು MBP ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (SI ಅನುಬಂಧ, ಕೋಷ್ಟಕ S1).(B) Nsp9-His6 ರೂಪಾಂತರವು ಒಂದು ಅಥವಾ ಎರಡು N-ಟರ್ಮಿನಲ್ Asn ಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ (pp1a/pp1ab ನಲ್ಲಿನ ಸ್ಥಾನದ ಪ್ರಕಾರ ಶೇಷ ಸಂಖ್ಯೆ) ಮತ್ತು nsp12-His6 ಮತ್ತು [α-32P] UTP ಯೊಂದಿಗೆ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಬಿ, ಕೂಮಾಸ್ಸಿಯೊಂದಿಗೆ ಕಲೆ ಹಾಕಿರುವ SDS-PAGE ಅನ್ನು ಮೇಲ್ಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, B, ಅನುಗುಣವಾದ ಆಟೋರಾಡಿಯೋಗ್ರಾಫ್ ಅನ್ನು ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಮಾರ್ಕರ್ನ ಸ್ಥಾನವನ್ನು (ಕಿಲೋಡಾಲ್ಟನ್ಗಳಲ್ಲಿ) ಎಡಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಅಲಾ ಅಥವಾ ಸೆರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಅದೇ ಪ್ರಮಾಣದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು nsp12-His6 ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ UMPylation ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು SDS-PAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ (C, ಟಾಪ್) ನಿಂದ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ರೇಡಿಯೊಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ nsp9-His6 ಅನ್ನು ಫಾಸ್ಫೊರೆಸೆನ್ಸ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ (ಸಿ, ಮಧ್ಯಮ) ಮೂಲಕ ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಯಿತು.ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (wt) ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖವಾಗಿ (100% ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ) ಬಳಸಿ, ಸಂಬಂಧಿತ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು (ಸರಾಸರಿ ± SEM) ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.(D) HCoV-229E ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ Huh-7 ಕೋಶಗಳಿಂದ ಸೋಂಕಿತವಾಗಿರುವ Huh-7 ಜೀವಕೋಶಗಳ p1 ಸೆಲ್ ಕಲ್ಚರ್ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ನಲ್ಲಿನ ವೈರಸ್ ಟೈಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು nsp9 ನಲ್ಲಿ ಗೊತ್ತುಪಡಿಸಿದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ರೂಪಾಂತರಿತ ರೂಪಗಳನ್ನು ಪ್ಲೇಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿಕೃತಿ-ಕೊರತೆಯ RdRp ಮೋಟಿಫ್ C ಡಬಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್ DD4823/4AA ಅನ್ನು ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.
nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್ (ವಿಶೇಷವಾಗಿ 1, 2, 3, ಮತ್ತು 6 ಸ್ಥಾನಗಳು) ಆರ್ಥೋಕೊರೊನಾವೈರಿನೇ ಉಪಕುಟುಂಬದ ಸದಸ್ಯರಲ್ಲಿ ಬಹಳ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S6).nsp12-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ nsp9 NMPylation ನಲ್ಲಿ ಈ ಅವಶೇಷಗಳ ಸಂಭವನೀಯ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು, nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸತತ ಎರಡು Asn ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು Ala ಅಥವಾ Ser (ಒಂಟಿಯಾಗಿ ಅಥವಾ ಸಂಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ) ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು.ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ nsp9 ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, N3825 ಅನ್ನು Ala ಅಥವಾ Ser ನೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸುವುದರಿಂದ nsp12-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ UMPylation ನಲ್ಲಿ ಎರಡು ಪಟ್ಟು ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5C).N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಶೇಷದ ಅಡ್ಡ ಸರಪಳಿಯ ಬದಲಾಗಿ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್‌ನಲ್ಲಿ NMPylation ಸಂಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬ ನಮ್ಮ ತೀರ್ಮಾನಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, N3825A ಮತ್ತು N3825S ಅನ್ನು ಬದಲಿಸುವುದರೊಂದಿಗೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಉಳಿದಿರುವ NMPylation ಅನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಎರಡನೇ Asn ಅನ್ನು Ala ಅಥವಾ Ser ನಿಂದ ಬದಲಾಯಿಸಿದರೆ, nsp9 UMPylation ಹೆಚ್ಚು ಬಲವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ (10 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಬಾರಿ), ಆದರೆ 3, 4 ಮತ್ತು 6 ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ Ala ಅನ್ನು ಬದಲಿಸುವುದು nsp9 UMPylation (ಚಿತ್ರ 2) ಮೇಲೆ ಕೇವಲ ಮಧ್ಯಮ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಬೀರುತ್ತದೆ. )5C).ATP, CTP ಅಥವಾ GTP (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S8) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಡೇಟಾವು nsp9 NMPylation ನಲ್ಲಿ N2826 (nsp9 ರಲ್ಲಿ ಸ್ಥಾನ 2) ನ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
nsp9 ಮತ್ತು NMPylation ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್ ನಡುವಿನ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧದ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ನಾವು ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಕುಟುಂಬದ nsp9 ಅನುಕ್ರಮದ ಬಹು ಅನುಕ್ರಮ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು (MSA) ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ (104 ಮತ್ತು 113 ಶೇಷಗಳ ನಡುವೆ ವ್ಯತ್ಯಾಸವಿದೆ) (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S6).ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ವಿವಿಧ ಸಸ್ತನಿಗಳು, ಪಕ್ಷಿಗಳು ಮತ್ತು ಸರೀಸೃಪ ಸಂಕುಲಗಳಿಗೆ ಸೋಂಕು ತಗುಲಿಸುವ ಆರ್ಥೋಕೊರೊನಾವೈರಿನೇ ಉಪಕುಟುಂಬದ 5 ಕುಲಗಳ 47 (ತಿಳಿದಿರುವ ಮತ್ತು ಪ್ರಚೋದಕ) ಜಾತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಒಟ್ಟು 8 ಶೇಷಗಳು ಮಾತ್ರ ಬದಲಾಗದೆ ಇರುವುದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ.ಹಿಂದಿನ ರಚನಾತ್ಮಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳು (26 ??28) ನಿರ್ಧರಿಸಿದಂತೆ, ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳು ಮತ್ತು ಅಳವಡಿಕೆಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಅತ್ಯಂತ ವ್ಯಾಪಕವಾದ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು nsp9 ನ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯ ಅಂಶಗಳ ನಡುವಿನ ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.nsp9 ನ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಭಾಗದ β ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಮತ್ತು α ಹೆಲಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಐದು ಅಸ್ಥಿರ ಅವಶೇಷಗಳು ಕಂಡುಬಂದಿವೆ.ಮೂರು ಅಸ್ಥಿರ ಶೇಷಗಳು nsp9 ನ N ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನ NNE ಮೋಟಿಫ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ.ಈ ಮೋಟಿಫ್‌ನ ಎರಡನೇ ಅಸ್ನ್ ಒಂದೇ ಅಸ್ಥಿರ ಶೇಷವಾಗಿದೆ, ಇದು ದೂರದ ಸಂಬಂಧಿತ ಕಪ್ಪೆ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್‌ನ ಕಾಲ್ಪನಿಕ nsp9 ನಿಂದ ಹಂಚಿಕೊಳ್ಳಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ಆಲ್ಫಲೆಟೊವೈರಸ್‌ನ ಉಪಕುಟುಂಬದ ಲೆಟೊವಿರಿನೆಯಲ್ಲಿ ಮೈಕ್ರೋಹೈಲಾ ಲೆಟೊವೈರಸ್ 1 ಜಾತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.nsp9 ಸೆಕೆಂಡರಿ ರಚನೆಯ ಅಂಶಗಳಲ್ಲಿನ ಅವಶೇಷಗಳ ಸಂರಕ್ಷಣೆಯನ್ನು ರಚನಾತ್ಮಕ ಪರಿಗಣನೆಗಳ ಮೂಲಕ ಮಡಿಸುವ ಅಥವಾ ತಿಳಿದಿರುವ RNA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ತರ್ಕಬದ್ಧಗೊಳಿಸಬಹುದು.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ತಾರ್ಕಿಕತೆಯು NNE ಸಂರಕ್ಷಣೆಗೆ ಅನ್ವಯಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಈ ಅಧ್ಯಯನದ ಮೊದಲು, ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್ ಅನುಕ್ರಮದ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಮಿತಿಗೊಳಿಸುವ ನಿರ್ಬಂಧಗಳ ಸ್ವರೂಪವು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದೆ.
ಕರೋನವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಲ್ಲಿ nsp9-NMPylation ಮತ್ತು NNE ಸಂರಕ್ಷಣೆಯ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ನಾವು HCoV-229E ಮ್ಯಟೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು nsp9 N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಏಕ ಅಥವಾ ಎರಡು ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ವಿಟ್ರೋದಲ್ಲಿ nsp9 NMPylation ಹಾನಿಕಾರಕವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ನಾವು ಪ್ರಾರಂಭಿಸುವ ಮೊದಲು, ಈ ಪರ್ಯಾಯಗಳು (nsp8|9 ಕ್ಲೀವೇಜ್ ಸೈಟ್ ಬಳಿ) C-ಟರ್ಮಿನಲ್ pp1a ಪ್ರದೇಶದ ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆಯೇ ಎಂಬ ಪ್ರಶ್ನೆಗೆ ಉತ್ತರಿಸಲು ನಾವು ಪ್ರಯತ್ನಿಸುತ್ತೇವೆ.nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಅನುಗುಣವಾದ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ nsp7-11 ಪಾಲಿಪ್ರೋಟೀನ್ ರಚನೆಗಳ ಒಂದು ಸೆಟ್ ಅನ್ನು E. ಕೊಲಿಯಲ್ಲಿ ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮರುಸಂಯೋಜಕ Mpro ನೊಂದಿಗೆ ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು.ನಾಲ್ಕು ಸೈಟ್‌ಗಳ (nsp9 ಪಾರ್ಶ್ವದ ಸೈಟ್ ಸೇರಿದಂತೆ) ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕ್ ಸೀಳನ್ನು ಯಾವುದೇ ಪರಿಚಯಿಸಲಾದ ಪರ್ಯಾಯಗಳಿಂದ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S9) ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ, ಈ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ರಚನಾತ್ಮಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ, ಇದು Mpro-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ nsp8|9 ಸೀಳನ್ನು (ಅಥವಾ ಇತರೆ) ಜಾಲತಾಣ.
Huh-7 ಕೋಶಗಳನ್ನು ಜೀನೋಮ್-ಉದ್ದದ HCoV-229E RNA ಯೊಂದಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು, nsp9 N ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿತ NNE ಟ್ರಿಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (N3825, N3826, ಮತ್ತು E3827) ಅಲಾ ಅಥವಾ ಸೆರ್ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ ರೂಪಾಂತರಗಳು ಮಾರಕವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.N-ಟರ್ಮಿನಲ್ Asn (N2835A ಅಥವಾ N2835S) ನ Ser ಅಥವಾ Ala ಅನ್ನು ಬದಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ವೈರಸ್ ಅನ್ನು ರಕ್ಷಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಆದರೆ NNE ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿ (N3826A, N3826S, NN3825/6AA,) ಇತರ ಸಿಂಗಲ್ ಮತ್ತು ಡಬಲ್ ರೂಪಾಂತರಗಳೊಂದಿಗೆ ವೈರಸ್ ಅನ್ನು ಮರುಪಡೆಯಲು ವಿಫಲವಾಗಿದೆ. NN3825/6SS) , E3827A) (ಚಿತ್ರ 5D).
ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಅಂಗಾಂಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿನ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್‌ಗಳ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯನ್ನು ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ (ಅದೇ ಅಥವಾ ಅಂತಹುದೇ), ದೇಹದಲ್ಲಿ nsp9 NMPylation ಸೈಟ್‌ಗಳ ನೈಸರ್ಗಿಕ ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕರೋನವೈರಸ್ಗಳ ಜೀವನ ಚಕ್ರದಲ್ಲಿ ಈ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಕೊನೆಯ ಸೆಟ್‌ನಲ್ಲಿ, ನಾವು SARS-CoV-2 nsp12 ಮತ್ತು nsp9 ಎಂದು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ His6 ಮತ್ತು E. ಕೊಲಿಯಲ್ಲಿ nsp12 ನ ಎರಡು ರೂಪಾಂತರಿತ ರೂಪಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಿದ್ದೇವೆ.NiRAN ಮತ್ತು RdRp ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಅವಶೇಷಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ Ala ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 6A ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಕೋಷ್ಟಕ S2).SARS-CoV-2 nsp12 ರಲ್ಲಿ K4465 HCoV-229E ನಲ್ಲಿ K4135 ಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S2), ಇದು NiRAN ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು HCoV-229E ಪುನರಾವರ್ತನೆಗೆ (ಚಿತ್ರ 3D ಮತ್ತು E) ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆ.ಈ ಶೇಷವು ಅಪಧಮನಿಯ ವೈರಸ್ EAV nsp9 K94 ಶೇಷಕ್ಕೆ ಸಹ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ, ಇದು NiRAN ಸ್ವಯಂ-UMPylation/self-GMPylation (16) ಗೆ ಅಗತ್ಯವೆಂದು ಹಿಂದೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿತ್ತು.ಚಿತ್ರ 6B ಯಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ, SARS-CoV-2 nsp12 ಯು nsp9 ಅನ್ನು ತಲಾಧಾರವಾಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು UMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಆದರೆ nsp12_K4465A ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ರೂಪಾಂತರವು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯವಾಗಿದೆ.RdRp ಮೋಟಿಫ್ C ನ SDD ವಿಶಿಷ್ಟ ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿನ ಡಬಲ್ ಪರ್ಯಾಯವು UMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 6B), RdRp ಚಟುವಟಿಕೆಯು nsp9 UMPylation ನಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ನೇರ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.CTP, GTP ಮತ್ತು ATP (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S10) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇದೇ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಸಾರಾಂಶದಲ್ಲಿ, ಆರ್ಥೋಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಉಪಕುಟುಂಬದ ವಿವಿಧ ಕುಲಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ NiRAN-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ nsp9 NMPylation ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ಈ ಡೇಟಾ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
SARS-CoV-2 nsp12-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ NSP9 ನ NMPylation.(A) NMPylation ಪರೀಕ್ಷೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಿದ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುವ Coomassie ಸ್ಟೇನ್ಡ್ SDS-ಪಾಲಿಅಕ್ರಿಲಮೈಡ್ ಜೆಲ್.ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ, SARS-CoV-2 nsp12 ನ NiRAN ಡೊಮೇನ್ (K4465A) ಮತ್ತು RdRp ಡೊಮೇನ್ (DD5152/3AA) ನಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಪರ್ಯಾಯದೊಂದಿಗೆ ರೂಪಾಂತರಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಶೇಷ ಸಂಖ್ಯೆಯು pp1ab ನಲ್ಲಿನ ಸ್ಥಾನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ.(B) nsp9-His6 ಮತ್ತು [α-32P]UTP ಅನ್ನು nsp12-His6 (ವೈಲ್ಡ್ ಟೈಪ್ [wt] ಮತ್ತು ರೂಪಾಂತರಿತ) ತಲಾಧಾರವಾಗಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು UMPylation ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವಿಕೆಯ ಆಟೋರಾಡಿಯೋಗ್ರಾಫ್.ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಆಣ್ವಿಕ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿ (ಕಿಲೋಡಾಲ್ಟನ್ಗಳಲ್ಲಿ) ಎಡಭಾಗದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ Nidovirales (16) ನಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು Nidovirus ಪುನರಾವರ್ತನೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಕಿಣ್ವಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಕರೋನವೈರಸ್‌ನ NiRAN ಡೊಮೇನ್ NMP (NTP ಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ) nsp9 ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಇದು ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ನಿಗೂಢ RNA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ (26 ?? 29 ), ಇದು ನೈಸರ್ಗಿಕ ಗುರಿಯಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಮತ್ತು ಕರೋನವೈರಸ್ RTC ಯ ಪಾಲುದಾರ.
NiRAN ಡೊಮೇನ್ ಮೂರು ಅನುಕ್ರಮ ಮೋಟಿಫ್‌ಗಳನ್ನು (AN, BN, ಮತ್ತು CN) ಹಂಚಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಇದು ಮೊನೊಫೈಲೆಟಿಕ್ ಆದರೆ ಹೆಚ್ಚು ವಿಭಿನ್ನವಾದ ನಿಡೋವೈರಲ್ಸ್ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ (8, 16) ಎಲ್ಲಾ ಕುಟುಂಬಗಳಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಅತಿ ಕಡಿಮೆ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.ಇತ್ತೀಚಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಅವು ರಚನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್ ತರಹದ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಗುರುತಿಸದ ಕುಟುಂಬಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ, ಇದನ್ನು ಮೂಲತಃ SelO ಕುಟುಂಬ ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು (17, 19, 22, 30, 31).SelO-ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಕೈನೇಸ್ ಮಡಿಕೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಕೈನೇಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (22, 32) ಹಲವಾರು ಸಂರಕ್ಷಿತ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ.ATP ಅಣುಗಳ ಹಿಮ್ಮುಖ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ಆಧರಿಸಿ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಂವಹನಗಳಿಂದ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ, SelO ಅನ್ನು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ AMP (ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬದಲಿಗೆ) ಅನ್ನು ಪ್ರೋಟೀನ್ ತಲಾಧಾರಕ್ಕೆ (22) ವರ್ಗಾಯಿಸಲು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಆದರೆ ಮತ್ತೊಂದು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ SelO ತರಹದ ಪ್ರೋಟೀನ್ YdiU ಹೊಂದಿದೆ. ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಟೈರ್‌ಗೆ UMP ಯ ಕೋವೆಲನ್ಸಿಯ ಲಗತ್ತನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸಲು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ತಲಾಧಾರಗಳ ಅವನ ಅವಶೇಷಗಳು (33).
ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಭವಿಷ್ಯವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಲು ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಿಸಲು, ನಾವು ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ nsp12 (ಚಿತ್ರ 3D ಮತ್ತು E ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S3 ಮತ್ತು ಕೋಷ್ಟಕ) S1â ನಲ್ಲಿ ರೂಪಾಂತರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮಾಡಲು ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. S4).HCoV-229E K4135, R4178 ಮತ್ತು D4280 ಅನ್ನು ಅಲಾದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸುವುದರಿಂದ ವಿಟ್ರೊ NMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯನ್ನು ನಿವಾರಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3D ಮತ್ತು E ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧಗಳು, ಚಿತ್ರ S3), NTP γ-ಫಾಸ್ಫೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ. (K4135, R4178) ಮತ್ತು ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಲೋಹದ ಅಯಾನುಗಳ ಸಮನ್ವಯ (D4280).K4135 (17) ಸ್ಥಾನವನ್ನು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಲು ಮುಂಗಾಣಲಾದ ಪಕ್ಷಿಗಳ ಗೂಡಿನ ವೈರಸ್‌ನ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಗ್ಲುವಿನ E4145A ಪರ್ಯಾಯವು ವೈರಲ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯನ್ನು ತೊಡೆದುಹಾಕಲು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಆಶ್ಚರ್ಯಕರವಾಗಿ, ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ NMPylation ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3D ಮತ್ತು E ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S3 ಮತ್ತು ಕೋಷ್ಟಕಗಳು S1-S4).ಸಾಲ್ಮೊನೆಲ್ಲಾ ಟೈಫಿಮುರಿಯಮ್ (E130A) (33) ನ YdiU ಹೋಮೋಲಾಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಅನುಗುಣವಾದ ಪರ್ಯಾಯವನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಿದಾಗ ಇದೇ ರೀತಿಯ ವೀಕ್ಷಣೆಯನ್ನು ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ಡೇಟಾವು ವೇಗವರ್ಧಕ ಕ್ರಿಯೆಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಈ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಶೇಷದ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ.
HCoV-229E NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ (8) ನೆಸ್ಟೋವೈರಸ್‌ನ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯೊಳಗೆ ಸಂರಕ್ಷಿತ Phe ಶೇಷವನ್ನು (F4281A) ಬದಲಾಯಿಸುವುದರಿಂದ ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆ ಮತ್ತು ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 3D, E ಮತ್ತು SI) ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S3).ಡೇಟಾವು ಈ ಶೇಷದ ಪ್ರಮುಖ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಾರ್ಯದೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಹೋಮೋಲೋಗಸ್ DFG ಮೋಟಿಫ್ Phe ಶೇಷವನ್ನು ಹಿಂದೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, ಇದು Mg2+ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಲೂಪ್‌ನ ಭಾಗವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಬೆನ್ನುಮೂಳೆಯನ್ನು ಜೋಡಿಸಲು ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ???ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ವೇಗವರ್ಧಕ ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಿದೆ (32, 34).Ala ಮತ್ತು Arg ಅನ್ನು K4116 ಶೇಷಗಳಿಗೆ (ಪ್ರೀಎಎನ್ ಮೋಟಿಫ್‌ನಲ್ಲಿ) ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿ, ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಿದಂತೆ, ಪರಿಚಯಿಸಲಾದ ಅಮೈನೋ ಆಸಿಡ್ ಸೈಡ್ ಚೈನ್ ಅನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ, ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ NMP ವರ್ಗಾವಣೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ವಿಭಿನ್ನ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಬೀರಿತು (ಚಿತ್ರ 3D ಮತ್ತು E ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧಗಳು , ಚಿತ್ರ S3).ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಡೇಟಾವು ರಚನಾತ್ಮಕ ಮಾಹಿತಿಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಈ ಶೇಷವು ATP ಫಾಸ್ಫೇಟ್ (17) ನೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಇತರ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್ ಕುಟುಂಬಗಳ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ನ ಸ್ಥಾನವನ್ನು Lys, Arg ಅಥವಾ His (8) ಆಕ್ರಮಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ, ಇದು ಈ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅವಶೇಷದ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ನಿರ್ಬಂಧವನ್ನು ಸಡಿಲಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.D4188A ಮತ್ತು D4283A ನ ಪರ್ಯಾಯವು ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ಬಲವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯನ್ನು ನಿವಾರಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3).ಈ ಎರಡು ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ (ಆದರೆ ಎಲ್ಲಾ ಅಲ್ಲ) ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (8) ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಪ್ರಮುಖ ಕುಟುಂಬ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಆದರೆ ಪ್ರಾಯಶಃ ವೇಗವರ್ಧಕವಲ್ಲದ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಕೊರೊನಾವೈರಿಡೆ ಅಥವಾ ಇತರ ನೆಸ್ಟಿಯೊವೈರಿಡೆ ಕುಟುಂಬಗಳಲ್ಲಿ (8) ಸಂರಕ್ಷಿಸದ ಹಲವಾರು ಇತರ Lys ಮತ್ತು Asp ಶೇಷಗಳ (K4113A, D4180A, D4197A ಮತ್ತು D4273A) ಅಲಾ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, ಈ ಪರ್ಯಾಯಗಳು ಬಹುಮಟ್ಟಿಗೆ ಸಹಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಲ್ಲವು, ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ವಲ್ಪ ಇಳಿಕೆ ಮತ್ತು ಕೆಲವು ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ ವೈರಲ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆ (ಚಿತ್ರ 3 ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S3).ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಮ್ಯುಟಾಜೆನೆಸಿಸ್ ಡೇಟಾವು EAV NiRAN-RdRp (16) ನ ಸ್ವಯಂ-GMP ಮತ್ತು ರಿವರ್ಸ್ ಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ಬಹಳ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಇದರಲ್ಲಿ EAV nsp9 (ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ nsp12 ಆರ್ಥೋಲಾಗ್) ಶೇಷ K94 (HCoV- 229E K4135 ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ) ಪ್ರಮುಖ ಕಾರ್ಯಗಳು. R124 (R4178 ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ), D132 (D4188 ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ), D165 (D4280 ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ), F166 (F4281 ಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ).ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, HCoV-229E ಮ್ಯುಟಾಜೆನೆಸಿಸ್ ಡೇಟಾವು ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ SARS-CoV ರಿವರ್ಸ್ ಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾ (16) ಕ್ಕೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಇದು ಅನುಗುಣವಾದ CN ಮೋಟಿಫ್ Phe-to-Ala ರೂಪಾಂತರಿತ SARS-CoV_nsp12 ಗೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ. ಫಿನೋಟೈಪ್ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ -F219A ಮತ್ತು HCoV-229E_F4281A (ಚಿತ್ರ 3 D ಮತ್ತು E ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S3 ಮತ್ತು ಟೇಬಲ್ S1-S4).
ಯುಟಿಪಿ ಮತ್ತು ಜಿಟಿಪಿಗೆ (ಸ್ವಯಂ-ಎನ್‌ಎಂಪಿಲೇಷನ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ) ಸ್ಪಷ್ಟ ಆದ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಇಎವಿ ಆರ್ಥೋಲಾಗ್‌ಗಳಿಗೆ (16) ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ನಿರಾನ್ ಡೊಮೇನ್ (ಎಚ್‌ಸಿಒವಿ-229 ಇ ಮತ್ತು ಎಸ್‌ಎಆರ್‌ಎಸ್-ಕೋವಿ-2 ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ) ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನವು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ ನಾಲ್ಕು NMP ಗಳನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಗಿದೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ UMP ಗೆ ಸ್ವಲ್ಪ ಆದ್ಯತೆ ಇದೆ (ಚಿತ್ರಗಳು 1 ಮತ್ತು 3).ನಿರ್ದಿಷ್ಟ NTP ಸಹ-ತಲಾಧಾರದ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ವರದಿಯಾದ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ಸೂಪರ್‌ಕಾಂಪೊಸಿಟ್ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ADP-Mg2+ NiRAN ನ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಅಡೆನಿನ್ ಭಾಗದೊಂದಿಗೆ ಅಲ್ಲ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಂವಹನಗಳ ರಚನೆಯ (17).ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, NMPylation ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುವ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್ ಪ್ರಕಾರವು ರೂಪಾಂತರಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S3) ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಯಾವುದೇ ಭೇದಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ, ಈ ಯಾವುದೇ ಅವಶೇಷಗಳು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಬೇಸ್‌ನ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಗೆ ನಿಕಟ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಕರೋನವೈರಸ್ ಮತ್ತು ಅಪಧಮನಿಯ ವೈರಸ್‌ಗಳ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ವಿಭಿನ್ನ NTP ಸಹ-ತಲಾಧಾರ ಪ್ರಾಶಸ್ತ್ಯಗಳ ರಚನಾತ್ಮಕ ಆಧಾರ ಮತ್ತು ಸಂಭಾವ್ಯ ಜೈವಿಕ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಬೇಕಾಗಿದೆ;ಅವು ನಿಜವಾಗಿರಬಹುದು ಅಥವಾ ಅವರ ಆಯಾ ಅಧ್ಯಯನಗಳ ಮಿತಿಗಳ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿರಬಹುದು.ಪ್ರಸ್ತುತ, ಅಪಧಮನಿಯ ವೈರಸ್ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನ ಸಂಭಾವ್ಯ NMPylator ಚಟುವಟಿಕೆಯು (ಹಿಂದೆ ನಿರೂಪಿಸಲಾದ ಸ್ವಯಂ-NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ) ವಿಭಿನ್ನ ಸಹ-ತಲಾಧಾರ ಆದ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಅಪಧಮನಿ ಮತ್ತು ಕರೋನವೈರಸ್ ನಡುವಿನ ಹೋಲಿಕೆಯನ್ನು ಗಣನೆಗೆ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. NiRAN ಡೊಮೇನ್ ಅದರ ಮಿತಿಯಲ್ಲಿದೆ.ಅನುಕ್ರಮ-ಆಧಾರಿತ ಹೋಲಿಕೆ (16).Mg2+ ಅನ್ನು ಸಹಕಾರಿಯಾಗಿ ಬಳಸುವ ಸ್ಯೂಡೋಕಿನೇಸ್ SelO ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಮತ್ತು ಅಪಧಮನಿಯ ವೈರಸ್ NiRAN ನ ಚಟುವಟಿಕೆಯು Mn2+ (16) ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3C ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S1).Mn2+ ಅವಲಂಬನೆ ಮತ್ತು UTP ಗಾಗಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಆದ್ಯತೆಯು ಪ್ರೊಟೀನ್ NMPylators ನ ಅಸಾಮಾನ್ಯ ಲಕ್ಷಣವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಸಾಲ್ಮೊನೆಲ್ಲಾ ಟೈಫಿಮುರಿಯಮ್‌ನ YdiU ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಲ್ಲಿ ದೃಢೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಇದು ಒತ್ತಡದ ಪ್ರೇರಣೆಯಿಂದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ರಕ್ಷಿಸಲು ಕಟ್ಟುನಿಟ್ಟಾದ Mn2+-ಅವಲಂಬಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಚಾಪೆರೋನ್ UMPylation ಅನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ ಸೆಲ್ ATP ಪೂಲ್ ( 33)
ಕರೋನವೈರಸ್ NiRAN ಡೊಮೇನ್ ಮತ್ತು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಕೈನೇಸ್‌ಗಳ (17, 19) ನಡುವಿನ ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ವಿವರಿಸಲಾದ ರಚನಾತ್ಮಕ ಹೋಲಿಕೆಯು ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ನಾವು ವರದಿ ಮಾಡಿರುವ ಇತರ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ NMP ಅನ್ನು ಕೋವೆಲೆಂಟ್ ಆಗಿ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡುವ NiRAN ನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.HCoV-229E ORF1a ನಿಂದ ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಸಂಭವನೀಯ NiRAN ಗುರಿಗಳಿಗಾಗಿ ನಾವು ನಮ್ಮ ಹುಡುಕಾಟವನ್ನು ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು RTC ಯ ORF1b-ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಿದ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗೆ ನೇರವಾಗಿ ಅಥವಾ ಪರೋಕ್ಷವಾಗಿ ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ (12, 35).ನಮ್ಮ ಪ್ರಯೋಗಗಳು nsp9 ನ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ NMPylation ಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 2).ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅನ್ನು ಮೋಲಾರ್ ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ ಬಳಸಿದರೆ ಅದು ಕಿಣ್ವಕ್ಕಿಂತ (ಎನ್‌ಎಸ್‌ಪಿ 12) 8 ರಿಂದ 10 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ಎನ್‌ಎಸ್‌ಪಿ 9 ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ (ಮೊನೊ)ಎನ್‌ಎಂಪಿ ಮಾಡಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4).nsp12 ಮತ್ತು nsp9 ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಅಲ್ಪಾವಧಿಯದ್ದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು nsp9 (ಇತರ RTC ಉಪಘಟಕಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ) ನೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾದ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ರೂಪಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ತೀರ್ಮಾನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ತೀರ್ಮಾನವನ್ನು SARS-CoV ಪ್ರೋಟೀಮ್ (35) ನಲ್ಲಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂವಾದದ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತವೆ.MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಶೇಷದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್ ಅನ್ನು NMPylation ಸೈಟ್ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಿದೆ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S5).ಫಾಸ್ಫೊರಮೈಡೇಟ್ ಬಂಧ ಮತ್ತು N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅಮಿನೊ ಗುಂಪಿನ ರಚನೆಯು NiRAN-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಸ್ಯೂಡೋಮೊನಾಸ್ ಸಿರಿಂಗೇ SelO-ಮಧ್ಯಸ್ಥ AMPylation ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು Ser, Thr, ಅಥವಾ ಟೈರ್ ಅವಶೇಷಗಳಲ್ಲಿ O- ಲಿಂಕ್ಡ್ AMP ರಚನೆಯನ್ನು ವೇಗವರ್ಧಿಸುತ್ತದೆ. 22), ಮತ್ತು S. ಟೈಫಿಮುರಿಯಮ್ YdiU ಒ-ಲಿಂಕ್ಡ್ (ಟೈರ್‌ನೊಂದಿಗೆ) ಮತ್ತು ಎನ್-ಲಿಂಕ್ಡ್ (ಅವನ ಜೊತೆ) ಪೆಪ್ಟೈಡ್-ಯುಎಂಪಿ ಅಡಕ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ SelO ಕುಟುಂಬದ ಮೇಲೆ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಸೀಮಿತ ಮಾಹಿತಿಯು ಈ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕುಟುಂಬದ ಸದಸ್ಯರು ಪೆಪ್ಟೈಡ್-NMP ವ್ಯಸನಗಳ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕೆ ಅರ್ಹವಾದ ಆಸಕ್ತಿದಾಯಕ ವೀಕ್ಷಣೆಯಾಗಿದೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಡೇಟಾವು nsp9 ನ NMPylation ಗೆ ಉಚಿತ N-ಟರ್ಮಿನಸ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆಯೆಂದು ಊಹಿಸಲು ನಮಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು.ವೈರಲ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, Mpro ಮತ್ತು pp1ab ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಲ್ಲಿನ ಪ್ರತಿಕೃತಿ ಪಾಲಿಪ್ರೋಟೀನ್ pp1a ನಲ್ಲಿ nsp8|nsp9 ಸಂಸ್ಕರಣಾ ಸೈಟ್‌ನ ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕ್ ಸೀಳಿನಿಂದ ಇದನ್ನು ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, ಈ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸೈಟ್ (HCoV-229E ನಲ್ಲಿ VKLQ|NNEI) ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಇತರ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ Mpro ಸೀಳುವ ಸೈಟ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು Asn (ಅಲಾ, ಸೆರ್ ಅಥವಾ ಗ್ಲೈನಂತಹ ಮತ್ತೊಂದು ಸಣ್ಣ ಶೇಷಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ) P1â ಅನ್ನು ಆಕ್ರಮಿಸುತ್ತದೆ???ಸ್ಥಳ (36).ಆರಂಭಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸೀಳುವಿಕೆಯ ದತ್ತಾಂಶವು nsp8|nsp9 ಸೈಟ್‌ನ ಸೀಳುವಿಕೆಯ ದಕ್ಷತೆಯು ಇತರ ಸೈಟ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, 1) ಈ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸೈಟ್ ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಲ್‌ನ ಸಮಯೋಚಿತ ಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಕ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. pp1a ಪ್ರದೇಶ, ಅಥವಾ 2) a ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಲ್ಲಿ ವಿಶೇಷ ಸಂರಕ್ಷಿತ nsp9 N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನ ಪಾತ್ರ (37).ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ (ಚಿತ್ರ 5A) ನೈಜ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ nsp9 ನ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ರೂಪವು nsp12 ನಿಂದ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ NMP ಮಾಡಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪಾರ್ಶ್ವದ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ Xa (nsp9-His6; SI ಅನುಬಂಧ, ಟೇಬಲ್ S1) ಅಥವಾ Mpro-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ ಸೀಳಿಕೆ (nsp7-11-His6; ಚಿತ್ರ 5A ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಟೇಬಲ್ S1) ಮೂಲಕ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, ಕತ್ತರಿಸದ nsp9-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪೂರ್ವಗಾಮಿ nsp7-11-His6 nsp12 ನ NMPylation ಗೆ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ, ಇದು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ, nsp9-NMP ಅಡಕ್ಟ್ ಅನ್ನು N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S5) ಮೂಲಕ ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. .NiRAN ತಲಾಧಾರದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಬಗ್ಗೆ ಆಳವಾದ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ನಾವು ನಂತರ nsp9 ನ ಪಕ್ಕದ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಇತರ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, ಅವು ರಚನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ, ಅವುಗಳನ್ನು nsp9 (26 28, 38) ನ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವುದನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ, ಅವುಗಳ ಸೀಮಿತ ನೈಸರ್ಗಿಕ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಪ್ರಮುಖ ಅನುಕ್ರಮ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ (ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿಲ್ಲ) nsp9 N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ತುಣುಕಿನ ಕಾರ್ಯ.ಈ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಶೇಷಗಳ ಅಲಾ ಪರ್ಯಾಯಗಳು (ಚಿತ್ರಗಳು 5C ಮತ್ತು D ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S8) N3826 ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ nsp9 NMPylation ಗೆ ಅತ್ಯಗತ್ಯ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ N3825A ಮತ್ತು E3827A ಪರ್ಯಾಯಗಳು NMPylation ನಲ್ಲಿ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ, ಆದರೆ M3820A ಮತ್ತು P3820A ಪರ್ಯಾಯಗಳು ಇಲ್ಲ .ನಿಸ್ಸಂಶಯವಾಗಿ nsp9 NMPylation ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ.N-ಟರ್ಮಿನಲ್ Asn (N3825A, N3825S) ನ ಪರ್ಯಾಯವು nsp9 NMPylation ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶದ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯ ಮೇಲೆ ಕೇವಲ ಮಧ್ಯಮ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5C ಮತ್ತು D), N-ಟರ್ಮಿನಲ್ 3825-NN ಡೈಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನಿಂದ Asn ಶೇಷ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಅಳಿಸುವುದು ಇದು ವೈರಸ್‌ಗಳಿಗೆ ಮಾರಕವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆ, N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತೊಂದು ಶೇಷದ ಮೊದಲು ಒಂದು Asn ಶೇಷ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಮೇಲಾಗಿ Asn, ಆದರೂ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಅವಶೇಷಗಳ ಪರ್ಯಾಯವನ್ನು ಭಾಗಶಃ ಸಹಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 5B, C, ಮತ್ತು D).3825-NN ಡೈಪೆಪ್ಟೈಡ್, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಕರೋನವೈರಸ್ ಶ್ರೇಣಿಯೊಳಗೆ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S6) ಸಂರಕ್ಷಿತ ಮತ್ತು ಅಗತ್ಯವಾದ N3826 ಶೇಷವು NiRAN ನ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ nsp9 N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನ ಸರಿಯಾದ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮತ್ತು ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೀರ್ಮಾನಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಎಲ್ಲಾ ಉಪಕುಟುಂಬಗಳ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಗ್ಲುಗೆ Ala (E3827A) ಅನ್ನು ಬದಲಿಸುವುದು ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ nsp9 NMPylation ಅನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಆದರೆ ಜೀವಕೋಶದ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ವೈರಸ್‌ಗಳಿಗೆ ಮಾರಕವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5C ಮತ್ತು D), ಈ ಶೇಷದ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಪ್ರಮುಖ ಸಂವಹನಗಳಲ್ಲಿ (NMPylated ಅಥವಾ unmodified) ) nsp9 N-ಟರ್ಮಿನಸ್ ಮತ್ತು ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಇತರ ಅಂಶಗಳು.Nsp9 ರೂಪಾಂತರಗಳು nsp9 ಅಥವಾ ಯಾವುದೇ ಪಕ್ಕದ nsps (39) ನ ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ (SI ಅನುಬಂಧ, ಚಿತ್ರ S9), ಗಮನಿಸಲಾದ ಹಲವಾರು nsp9 ರೂಪಾಂತರಗಳ ಮಾರಕ ಫಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳು C ಪ್ರೋಟಿಯೋಲೈಟಿಕ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆ-ಟರ್ಮಿನಲ್ pp1a ಪ್ರದೇಶದ ಅನಿಯಂತ್ರಣದಿಂದ ಉಂಟಾಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. .
ಮೇಲಿನ ಡೇಟಾವು pp1a/pp1ab ನಲ್ಲಿ nsp8|9 ಕ್ಲೀವೇಜ್ ಸೈಟ್‌ನ Mpro-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ನಂತರ, nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್ ಅನ್ನು UMPylated ಮಾಡಬಹುದು (ಅಥವಾ ಇನ್ನೊಂದು NMP ಯೊಂದಿಗೆ ಭಾಗಶಃ ಮಾರ್ಪಡಿಸಬಹುದು).ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, nsp9 ನ N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಸಂರಕ್ಷಣೆ (ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಕುಟುಂಬದಲ್ಲಿನ ಏಕವಚನ ಮತ್ತು ಅಸ್ಥಿರವಾದ Asn ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ) ಮತ್ತು ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ರಿವರ್ಸ್ ಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ಡೇಟಾ (ಚಿತ್ರಗಳು 3E ಮತ್ತು 5D) ವಿವರಿಸಿದ nsp9 NMPylation ಎಂದು ತೀರ್ಮಾನಿಸಲು ನಮಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು. ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗೆ ಜೈವಿಕವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಅವಶ್ಯಕವಾಗಿದೆ.ಈ ಮಾರ್ಪಾಡಿನ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಉಳಿದಿದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ (ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ) nsp9 (ಮಾರ್ಪಡಿಸದ ರೂಪ) RNA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆ (2628).N-ಟರ್ಮಿನಲ್ NMPylation ಸಹ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಥವಾ RNA ತಲಾಧಾರಗಳೊಂದಿಗೆ nsp9 ನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು ಅಥವಾ ವಿವಿಧ ನಾಲ್ಕು-ಹಂತದ ಅಸೆಂಬ್ಲಿಗಳ ರಚನೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಬಹುದು.ಇವುಗಳನ್ನು ರಚನಾತ್ಮಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ ಈ ಮಾರ್ಪಾಡಿನ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ (26- ââ29, 40).
ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನ ಗುರಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಇನ್ನೂ ಹೆಚ್ಚು ವಿವರವಾಗಿ ನಿರೂಪಿಸಬೇಕಾಗಿದ್ದರೂ, ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಗುರಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಿರಿದಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಎಲ್ಲಾ ನಿಡೋವೈರಸ್ ಕುಟುಂಬಗಳ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಪ್ರಮುಖ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್ ಅವಶೇಷಗಳ (8, 16) ಸಂರಕ್ಷಣೆಯು ಸಂರಕ್ಷಿತ NMPylator ಈ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಬಲವಾಗಿ ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆಯಾದರೂ, ಈ ಡೊಮೇನ್‌ನ ತಲಾಧಾರ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪಾಕೆಟ್ ಅವಶೇಷಗಳ ಗುರುತು ಸಂರಕ್ಷಣೆ ಮತ್ತು ಸಂರಕ್ಷಣೆಯನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಉಳಿದಿದೆ. , ಮತ್ತು ನಿಡೋವೈರಲ್ಸ್ ಉದ್ದೇಶಗಳ ವಿವಿಧ ಕುಟುಂಬಗಳ ನಡುವೆ ಭಿನ್ನವಾಗಿರಬಹುದು.ಅಂತೆಯೇ, ಇತರ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳ ಸಂಬಂಧಿತ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಇನ್ನೂ ನಿರ್ಧರಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ.ಅವು nsp9 ಅಥವಾ ಇತರ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ರಿಮೋಟ್ ಆರ್ಥೋಲಾಗ್‌ಗಳಾಗಿರಬಹುದು, ಏಕೆಂದರೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿರುವ ಐದು ಪ್ರತಿಕೃತಿ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳ ಹೊರಗಿನ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಕಡಿಮೆ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ (8), Mpro ಮತ್ತು NiRAN ನಡುವಿನ ಜೀನೋಮ್ ಅರೇ ಸೇರಿದಂತೆ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ nsp9 ಇದೆ ಕೊರೊನಾ ವೈರಸ್.
ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, NiRAN ಡೊಮೇನ್ ಹೆಚ್ಚುವರಿ (ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸೇರಿದಂತೆ) ಗುರಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ನಾವು ಪ್ರಸ್ತುತ ತಳ್ಳಿಹಾಕಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ.ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಈ ಉದಯೋನ್ಮುಖ ಪ್ರೊಟೀನ್ NMPylators (NMPylators) (30, 31) ನಲ್ಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೋಮೊಲಾಗ್ಗಳು "ಮಾಸ್ಟರ್ ರೆಗ್ಯುಲೇಟರ್ಗಳು" ತೋರುತ್ತಿವೆ ಎಂದು ನಮೂದಿಸುವುದು ಯೋಗ್ಯವಾಗಿದೆ?NMP ವಿವಿಧ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಅವುಗಳ ಕೆಳಮಟ್ಟದ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲು ಅಥವಾ ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಮಾರ್ಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಒತ್ತಡ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮತ್ತು ರೆಡಾಕ್ಸ್ ಹೋಮಿಯೋಸ್ಟಾಸಿಸ್ (22, 33) ನಂತಹ ವಿವಿಧ ಜೈವಿಕ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರಗಳು 2 ಮತ್ತು 4 ಮತ್ತು SI ಅನುಬಂಧ, ಅಂಕಿಅಂಶಗಳು S3 ಮತ್ತು S5), nsp12 UMP (NMP) ಭಾಗವನ್ನು nsp9 ನಲ್ಲಿ ಒಂದೇ (ಸಂರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟ) ಸ್ಥಾನಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಆದರೆ ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಇದರಲ್ಲಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ. ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಚೆನ್ನಾಗಿ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲಾದ (ಸಡಿಲವಾದ ಬದಲು) ತಲಾಧಾರದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, N-ಟರ್ಮಿನಲ್ nsp9 NMPylation ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, nsp12's ಸ್ವಂತ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ, ಅದರ ಪತ್ತೆಗೆ ದೀರ್ಘವಾದ ಆಟೋರಾಡಿಯೋಗ್ರಫಿ ಎಕ್ಸ್ಪೋಸರ್ ಸಮಯ ಬೇಕಾಗುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು nsp12 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 10-ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ನಮ್ಮ MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು nsp12 ನ NMPylation ಗೆ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ವಿಫಲವಾಗಿದೆ, ಇದು NiRAN ಡೊಮೇನ್ ಸ್ವಯಂ-NMPylation ಒಂದು ದ್ವಿತೀಯಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ NMPylator ನ ಸ್ವಯಂ-AMPylation ಸ್ಥಿತಿಯು ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ತಲಾಧಾರಗಳ (22, 33) ಮೇಲೆ ಅವುಗಳ NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ಇತರ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸಿವೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕು.ಆದ್ದರಿಂದ, EAV nsp9 (16) ಮತ್ತು ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ nsp12 (ಈ ಅಧ್ಯಯನ) ಗಾಗಿ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಸ್ವಯಂ-NMPylation ಚಟುವಟಿಕೆಗಳ ಸಂಭವನೀಯ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಶೋಧನೆ ಅಗತ್ಯವಿದೆ, C-ಟರ್ಮಿನಲ್ RdRp ಡೊಮೇನ್ (C-ಟರ್ಮಿನಲ್ RdRp ಡೊಮೇನ್ (1) ಮಡಿಸುವ ಮೇಲೆ ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಲಾದ ಚಾಪೆರೋನ್ ತರಹದ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ. 16)).
ಹಿಂದೆ, RNA ಲಿಗೇಸ್, RNA-ಕ್ಯಾಪ್ಡ್ ಗ್ವಾನಿಲೇಟ್ ವರ್ಗಾವಣೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆ (16) ಸೇರಿದಂತೆ ನಿಡೋವೈರಲ್ NiRAN ಡೊಮೇನ್‌ನ ಸಂಭವನೀಯ ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಕಾರ್ಯಗಳ ಕುರಿತು ಹಲವಾರು ಊಹೆಗಳನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದೂ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಕಾರ್ಯಗಳಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಕೆಳಗಿನ ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಮಾಹಿತಿಯು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಊಹೆಗಳನ್ನು ಮಾಡದೆ ನಿಖರವಾಗಿ ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಇರುತ್ತದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಪಡೆದ ಡೇಟಾವು NiRAN ಡೊಮೇನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಪ್ರೇರಿತ RNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಾರಂಭದಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ (ಆದರೆ ಸಾಬೀತುಪಡಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ).5 ರಲ್ಲಿ NiRAN ಡೊಮೇನ್ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಹಿಂದೆ ನಂಬಲಾಗಿತ್ತು??²-ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಅಥವಾ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಬಂಧನ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳು ಇವುಗಳಿಂದ ಮತ್ತು ಇತರ ಡೇಟಾದ ಬೆಂಬಲದಿಂದ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗುವುದಿಲ್ಲ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, NiRAN ನ ಸಕ್ರಿಯ ತಾಣವು ಸಂರಕ್ಷಿತ Asp ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯ ಆಧಾರವಾಗಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗಿದೆ (ಸ್ಯೂಡೋಮೊನಾಸ್ ಸಿರಿಂಗೇ SelO ನಲ್ಲಿ D252; HCoV-229E pp1ab ನಲ್ಲಿ D4271; SARS-CoV-2 nsp12 ನಲ್ಲಿ D208) (SI ಅನುಬಂಧ 2 ಚಿತ್ರ 2 )S2) (17, 22, 33), ಆದರೆ ATP-ಅವಲಂಬಿತ RNA ಲಿಗೇಸ್ ಮತ್ತು RNA ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವದಲ್ಲಿನ ವೇಗವರ್ಧನೆಯು ಕೋವೆಲನ್ಸಿಯ ಕಿಣ್ವ-(lysyl-N)-NMP ಮಧ್ಯಂತರದಿಂದ ನಡೆಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ, ಇದು ಬದಲಾಗದ Lys ಶೇಷವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ ( 41)ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಸಂರಕ್ಷಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಗುರಿಗಳಿಗಾಗಿ ಕರೋನವೈರಸ್ NiRAN ನ ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಅನುಕ್ರಮ-ಆಧಾರಿತ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು NTP ಸಹ-ತಲಾಧಾರಗಳಿಗೆ (UTP ಆದ್ಯತೆ) ಶಾಂತವಾದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯು NiRAN-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ ಕ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಕಿಣ್ವ ಅಥವಾ RNA ಲಿಗೇಸ್ ತರಹದ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ವಿರೋಧಿಸುತ್ತದೆ.
ನಿಸ್ಸಂಶಯವಾಗಿ, ಪರಿಶೀಲಿಸಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಕೆಲಸದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಮತ್ತು ಸಾಬೀತಾದರೆ, ಪ್ರೋಟೀನ್-ಪ್ರೇರಿತ RNA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ nsp9-UMP (nsp9-NMP) ಯ ಸಂಭವನೀಯ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಹಲವಾರು ಆಸಕ್ತಿದಾಯಕ ಆದರೆ (ಇದುವರೆಗೆ) ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ವರದಿಗಳನ್ನು ಸಂಪರ್ಕಿಸುತ್ತದೆ. .ಪ್ರತ್ಯೇಕ ವೀಕ್ಷಣೆಗಳು.ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಕರೋನವೈರಸ್‌ನ ಋಣಾತ್ಮಕ-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅಂತ್ಯವು ಆಲಿಗೊ (ಯು) ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ (42, 43).ಈ ಅವಲೋಕನವು ಋಣಾತ್ಮಕ-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಆರ್ಎನ್ಎಯ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯು nsp9 ನ UMPylated ರೂಪವನ್ನು ಪಾಲಿ(A) ಟೈಲ್ (ಪ್ರಚೋದಕಗಳು) ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಕಲ್ಪನೆಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಇದು ಅದರ RNA ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಉತ್ತೇಜಿಸಬಹುದು. ಮತ್ತೊಂದು RTC ಪ್ರೋಟೀನ್.nsp9 ಒದಗಿಸಿದ UMP ಭಾಗವನ್ನು ನಂತರ nsp7/8/nsp12-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ ಆಲಿಗೌರಿಡೈಲೇಷನ್‌ಗಾಗಿ "ಪ್ರೈಮರ್" ಆಗಿ ಬಳಸಬಹುದು, ಜೀನೋಮಿಕ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಲ್ಲಿ 3??²-ಪಾಲಿ(ಎ) ಟೈಲ್ ಅಥವಾ ಇನ್ನೊಂದು ಒಲಿಗೋ (ಎ)-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಬಳಸಿ ಪಿಕಾರ್ನವೈರಸ್ VPg ಪ್ರೊಟೀನ್ (44) ಗಾಗಿ ಸ್ಥಾಪಿಸಲಾದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದಂತೆಯೇ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರಸ್ತಾಪವು "ನಿಯಮೇತರ" ಆಗಿದ್ದರೆ ಏನು????(ಪ್ರೋಟೀನ್-ಪ್ರೇರಿತ) ಋಣಾತ್ಮಕ-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಾರಂಭವು ಅವಲೋಕನಗಳಿಗೆ ಲಿಂಕ್ ಅನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಋಣಾತ್ಮಕ-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅದರ ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಯುಎಂಪಿ (ಯುಟಿಪಿ ಬದಲಿಗೆ) ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (42), ಇದನ್ನು ಸೂಚಿಸಲು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗಿದೆ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಡೈಸರ್ ಅಜ್ಞಾತ ಯುರಿಡಿನ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಎಂಡೋನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್‌ನಿಂದ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಟ್ ಮಾಡಿದ ಅಂತ್ಯವನ್ನು ಸೀಳುತ್ತದೆ.ದೃಢಪಡಿಸಿದರೆ, ಈ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಹೈಡ್ರೊಲೈಟಿಕ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು nsp9 ನ ಆಲಿಗೋಮೆರಿಕ್ UMPylated ರೂಪವನ್ನು ಹೊಸ ಋಣಾತ್ಮಕ ಎಳೆಯ 5² ಅಂತ್ಯದಿಂದ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪ್ರೈಮಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ nsp9 ನ ಸಂಭವನೀಯ ಪಾತ್ರವು ಹಿಂದಿನ ರಿವರ್ಸ್ ಜೆನೆಟಿಕ್ಸ್ ಅಧ್ಯಯನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಇದು nsp9 (ಮತ್ತು nsp8) ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಜೀನೋಮ್‌ನ 3 ಅಂತ್ಯದ ಬಳಿ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಸಿಸ್-ಆಕ್ಟಿಂಗ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅಂಶದೊಂದಿಗೆ ವಿಮರ್ಶಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.45)ಈ ವರದಿಯ ಪ್ರಕಾರ, ಈ ಹಿಂದಿನ ಅವಲೋಕನಗಳನ್ನು ಈಗ ಮರುಪರಿಶೀಲಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಮೂಲಕ ವಿಸ್ತರಿಸಬಹುದು.
ಸಾರಾಂಶದಲ್ಲಿ, N-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ RdRp ಗೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾದ ಸ್ವಾಮ್ಯದ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್ ಕಿಣ್ವ ಟ್ಯಾಗ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ.ಕೊರೊನಾವೈರಸ್‌ನಲ್ಲಿ, ಹೊಸದಾಗಿ ಪತ್ತೆಯಾದ ಈ NiRAN-ಮಧ್ಯಸ್ಥ UMPylator/NMPylator ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು Mn2+ ಮತ್ತು ಪಕ್ಕದ Asn ಅವಶೇಷಗಳ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಅಮೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ (ಕಡಿಮೆ-ಶಕ್ತಿ) ಫಾಸ್ಫೊರಮೈಡೇಟ್ ಬಂಧಗಳ ರಚನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.nsp8|9 ಸೀಳುವಿಕೆ ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ Mpro-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಸೀಳುವಿಕೆಯ ಮೂಲಕ, NMP9 ಗುರಿಯನ್ನು NMPylation ಗೆ ಬಳಸಬಹುದು, ಇದು ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಮತ್ತು NiRAN ಡೊಮೇನ್ ನಡುವಿನ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಜೋಡಣೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು RdRp ವರೆಗೆ ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತದೆ.nsp12 NiRAN ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿನ ಪ್ರಮುಖ ಅವಶೇಷಗಳ ಸಂರಕ್ಷಣೆ ಮತ್ತು nsp9 ಗುರಿ, SARS-CoV-2 ಸೇರಿದಂತೆ ಎರಡು ಕೊರೊನಾವೈರಸ್‌ಗಳಿಂದ ಪಡೆದ ಡೇಟಾದೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, nsp9 NMPylation ಒಂದು ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಕನ್ಸರ್ವೇಟಿವ್ ವೈಶಿಷ್ಟ್ಯಗಳು ವೈರಸ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಯ ಪ್ರಮುಖ ಹಂತವಾಗಿದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ಬಲವಾದ ಪುರಾವೆಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.ಲಭ್ಯವಿರುವ ದತ್ತಾಂಶವು ಪ್ರೋಟೀನ್-ಪ್ರೇರಿತ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಎನ್‌ಎಸ್‌ಪಿ 9 ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪಾತ್ರವು ಕರೋನವೈರಸ್ ಮತ್ತು ಇತರ ನೆಸ್ಟೆಡ್ ವೈರಸ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಮಂಜಸವಾದ ಸನ್ನಿವೇಶವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೀರ್ಮಾನಿಸಲು ನಮಗೆ ದಾರಿ ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇತರ ಗುರುತಿಸಲಾಗದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ NiRAN ಗುರಿಯಾಗಿಸಬಹುದು.ವೈರಸ್ ಅನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಿ.ಹೋಸ್ಟ್ ಸಂವಹನ.ದೃಢಪಡಿಸಿದರೆ, ವೈರಲ್ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಒಳಗೊಳ್ಳುವಿಕೆಯು ಈ ಹಿಂದೆ ಪತ್ತೆಯಾದ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಮತ್ತು ಪಿಕಾರ್ನವೈರಸ್ ತರಹದ ಸೂಪರ್‌ಗ್ರೂಪ್ (9) ನಡುವೆ Mpro/3CLpro ಮತ್ತು RdRp ಡೊಮೇನ್‌ಗಳ ಅನುಕ್ರಮ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ (9), ಇವುಗಳನ್ನು ಈಗ ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಸ್ಥಾಪಿಸಲಾದ ಪಿಸೋನಿವೈರೈಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಏಕೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ ( 46) ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಮೂಲಭೂತ, ಆಯ್ದ ಮತ್ತು ಸಂಪ್ರದಾಯವಾದಿ ಕಿಣ್ವ ಚಟುವಟಿಕೆಗಳನ್ನು ಆಂಟಿವೈರಲ್ ಔಷಧಿಗಳಿಗೆ ಗುರಿಯಾಗಿ ಬಳಸಬಹುದು ಎಂದು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.NiRAN ನ ಸಕ್ರಿಯ ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲ್ಪಟ್ಟ nsp9 N- ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಗೆ (ಮತ್ತು ನಂತರದ ಮಾರ್ಪಾಡು) ಅಡ್ಡಿಪಡಿಸುವ ಸಂಯುಕ್ತಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಮತ್ತು ಬಹುಮುಖವಾದ ಆಂಟಿವೈರಲ್ ಔಷಧಿಗಳಾಗಿ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಬಹುದು, ವಿವಿಧ (ಉಪ) ಕುಲದ ಸೋಂಕುಗಳಿಂದ ಪ್ರಾಣಿ ಮತ್ತು ಮಾನವ ಕರೋನವೈರಸ್ಗಳ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾಗಿದೆ. SARS-CoV-2 ಮತ್ತು ಮಧ್ಯಪ್ರಾಚ್ಯ ಉಸಿರಾಟದ ಸಿಂಡ್ರೋಮ್ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಸೇರಿದಂತೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾದ ಕೊರೊನಾವೈರಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಕೋಡಿಂಗ್ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು RT-PCR ನಿಂದ HCoV-229E ಸೋಂಕಿತ Huh-7 ನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ RNA ಬಳಸಿ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ ಅಥವಾ SARS-CoV-2 ಸೋಂಕಿತ Vero E6 ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಅಬೀಜ ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.pMAL-c2 (ನ್ಯೂ ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್ ಜೈವಿಕ ಪ್ರಯೋಗಾಲಯ) ಅಥವಾ pASK3-Ub-CHis6 (47) ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ವೆಕ್ಟರ್ (SI ಅನುಬಂಧ, ಕೋಷ್ಟಕಗಳು S1 ಮತ್ತು S2).PCR-ಆಧಾರಿತ ಸೈಟ್-ನಿರ್ದೇಶಿತ ಮ್ಯುಟಾಜೆನೆಸಿಸ್ (48) ನಿಂದ ಏಕ ಕೋಡಾನ್ ಪರ್ಯಾಯಗಳನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು.MBP ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು, E. ಕೊಲಿ TB1 ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸೂಕ್ತವಾದ pMAL-c2 ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ರೂಪಾಂತರಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ (SI ಅನುಬಂಧ, ಕೋಷ್ಟಕ S1).ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಅಮೈಲೋಸ್ ಅಫಿನಿಟಿ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿಯಿಂದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಫ್ಯಾಕ್ಟರ್ Xa ನೊಂದಿಗೆ ಸೀಳಲಾಯಿತು.ತರುವಾಯ, C-ಟರ್ಮಿನಲ್ His6-ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ Ni-ನಿಶ್ಚಲ ಲೋಹದ ಅಫಿನಿಟಿ ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೋಗ್ರಫಿ (Ni-IMAC) ಮೂಲಕ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು (49).ubiquitin ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಉತ್ಪಾದಿಸಲು, E. coli TB1 ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸೂಕ್ತವಾದ pASK3-Ub-CHis6 ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ರಚನೆ (SI ಅನುಬಂಧ, ಕೋಷ್ಟಕಗಳು S1 ಮತ್ತು S2) ಮತ್ತು pCGI ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ DNA ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ubiquitin-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಹೈಡ್ರೋಲೇಸ್ 1 (Ubp1) ಅನ್ನು ಬಳಸಿದವು.ರೂಪಾಂತರ (47).C-ಟರ್ಮಿನಲ್ His6-ಟ್ಯಾಗ್ ಮಾಡಲಾದ ಕರೋನವೈರಸ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ (50).
EAV nsp9 (16) ನಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ HCoV-229E nsp12-His6 ನ ಸ್ವಯಂ-NMPylation ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, nsp12-His6 (0.5 µM) 50 mM 4-(2-ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಥೈಲ್)-1-ಪೈಪರಾಜಿನೀತನೆಸಲ್ಫೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM ಡಿಥಿಯೋಥ್ರೆಟಾಲ್ (DTT), 6 mM MnCl2, buffer 25 ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದ NTP ಮತ್ತು 0.17 µM ಹೊಂದಾಣಿಕೆ [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; ಹಾರ್ಟ್‌ಮನ್ ಅನಾಲಿಟಿಕ್) 30 °C ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳವರೆಗೆ.nsp12-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ nsp9 NMPylation ನ ಎಲ್ಲಾ ಇತರ (ಪ್ರಮಾಣಿತ) NMPylation ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ಸರಿಹೊಂದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ: nsp12-His6 (0.05 µM) ಮತ್ತು nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM ಸೂಚಿಸಿದ NTP, ಮತ್ತು 0.17 µM ಹೊಂದಾಣಿಕೆ [α32-P]NTP.30 ° C ನಲ್ಲಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವು ನೀಡಿದ ನಂತರ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಾದರಿಯನ್ನು SDS-PAGE ಮಾದರಿ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ: 62.5 mM ಟ್ರಿಸ್ (ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿಮೀಥೈಲ್) ಅಮಿನೊಮೆಥೇನ್ HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್ ಮತ್ತು 0.005% ನೀಲಿ.5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 90 °C ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಡಿನ್ಯಾಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 12% SDS-PAGE ನಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ ದ್ರಾವಣದೊಂದಿಗೆ (40% ಮೆಥನಾಲ್, 10% ಅಸಿಟಿಕ್ ಆಸಿಡ್, 0.05% ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಬ್ರಿಲಿಯಂಟ್ ಬ್ಲೂ R-250) ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ, ಬಣ್ಣರಹಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಫಾಸ್ಫೊರೆಸೆಂಟ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಪರದೆಯ ಮೇಲೆ 20 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ (NMPylation ನಿಂದ nsp12 ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು) ಒಡ್ಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅಥವಾ (ಗರಿಷ್ಠ) 2 ಗಂಟೆಗಳು (nsp9 NMPylation ಅನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು).ಪರದೆಯನ್ನು ಸ್ಕ್ಯಾನ್ ಮಾಡಲು ಟೈಫೂನ್ 9200 ಇಮೇಜರ್ (GE ಹೆಲ್ತ್‌ಕೇರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಸಿಗ್ನಲ್ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ImageJ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
MS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, 1 µM nsp12-His6 ಮತ್ತು 10 µM nsp9 (ಹೆಕ್ಸಾಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಟ್ಯಾಗ್ ಇಲ್ಲದೆ) NMPylation ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ (SI ಅನುಬಂಧ, ಟೇಬಲ್ S1) ಮತ್ತು 500 µM UTP ಮತ್ತು GTP ಯ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಅವುಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಗುಣಮಟ್ಟವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ, ಮಾಸ್‌ಪ್ರೆಪ್ ಕಾಲಮ್ (ವಾಟರ್ಸ್) ಹೊಂದಿರುವ ವಾಟರ್ಸ್ ಆಕ್ವಿಟಿ ಎಚ್-ಕ್ಲಾಸ್ ಎಚ್‌ಪಿಎಲ್‌ಸಿ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಆನ್‌ಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ 1 ರಿಂದ 10 µL ಬಫರ್ಡ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಪರಿಹಾರಗಳನ್ನು ಡೀಸಾಲ್ಟ್ ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಬಫರ್ A (ನೀರು/0.05% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ) ಮತ್ತು ಬಫರ್ B (ಅಸಿಟೋನೈಟ್ರೈಲ್/0.045% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ) ದ ಕೆಳಗಿನ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಮೂಲಕ ಸಿನಾಪ್ಟ್ G2Si ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ವಾಟರ್ಸ್) ನ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಪ್ರೇ ಅಯಾನು ಮೂಲವಾಗಿ ಉಪ್ಪುಸಹಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಹೊರಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕಾಲಮ್ ತಾಪಮಾನವು 60 ° C ಮತ್ತು 0.1 mL/ನಿಮಿಷದ ಹರಿವಿನ ಪ್ರಮಾಣ: 2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 5% A ಯೊಂದಿಗೆ ಐಸೊಕ್ರ್ಯಾಟಿಕ್ ಆಗಿ ಎಲುಶನ್, ನಂತರ 8 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 95% B ಗೆ ರೇಖೀಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು 4 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 95% B ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿ.
500 ರಿಂದ 5000 m/z ವರೆಗಿನ ದ್ರವ್ಯರಾಶಿಯ ಶ್ರೇಣಿಯೊಂದಿಗೆ ಧನಾತ್ಮಕ ಅಯಾನುಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಮಾಸ್ ಡ್ರಿಫ್ಟ್ ತಿದ್ದುಪಡಿಗಾಗಿ ಗ್ಲು-ಫೈಬ್ರಿನೊಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಬಿ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿ 45 ಸೆಕೆಂಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.MaxEnt1 ವಿಸ್ತರಣೆಯೊಂದಿಗೆ MassLynx ಉಪಕರಣ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ ಬೇಸ್‌ಲೈನ್ ಅನ್ನು ಕಡಿತಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ ಸರಾಸರಿ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅನ್ನು ಡಿಕಾನ್ವಾಲ್ವ್ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು ಸುಗಮಗೊಳಿಸಿ.
UMPylated HCoV-229E nsp9 ಅನ್ನು ಸೀಕ್ವೆನ್ಸಿಂಗ್-ಗ್ರೇಡ್ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ (ಸರ್ವಾ) ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಜೀರ್ಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 37 °C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಕ್ರೋಮಬಾಂಡ್ C18WP ಸ್ಪಿನ್ ಕಾಲಮ್ (ಭಾಗ ಸಂಖ್ಯೆ 730522; ಮಾಚೆರಿ-ನಾಗೆಲ್) ಅನ್ನು ಡೀಸಾಲ್ಟ್ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅನ್ನು 25 µL ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಯಿತು, ಇದರಲ್ಲಿ 5% ಅಸಿಟೋನೈಟ್ರೈಲ್ ಮತ್ತು 0.1% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲವಿದೆ.
ಆರ್ಬಿಟ್ರ್ಯಾಪ್ ವೆಲೋಸ್ ಪ್ರೊ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು MS ಮೂಲಕ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಅಂತಿಮ nanoâ HPLC ಸಿಸ್ಟಮ್ (ಡಯೋನೆಕ್ಸ್), ಕಸ್ಟಮ್ ಎಂಡ್-ಮೌಂಟೆಡ್ 50 ಸೆಂ.75 μm C18 RP ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು 2.4 μm ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ಮಣಿಗಳಿಂದ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (ಡಾ. ಆಲ್ಬಿನ್ ಮೈಶ್ ಹೈ ಪರ್ಫಾರ್ಮೆನ್ಸ್ LC GmbH) ಪ್ರೋಕ್ಸಿಯಾನ್ ನ್ಯಾನೊಸ್ಪ್ರೇ ಮೂಲದ ಮೂಲಕ ಆನ್‌ಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್‌ಗೆ ಸಂಪರ್ಕಪಡಿಸಿ;6 µL ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯ ದ್ರಾವಣವನ್ನು 300 µm ಒಳ ವ್ಯಾಸ × ??1 cm C18 PepMap ಪೂರ್ವ-ಸಾಂದ್ರೀಕರಣ ಕಾಲಮ್ (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್).ನೀರು/0.05% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ದ್ರಾವಕವಾಗಿ ಬಳಸಿ, ಮಾದರಿಯು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತವಾಗಿ ಸಿಕ್ಕಿಬಿದ್ದಿತು ಮತ್ತು 6 µL/ನಿಮಿಷದ ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ ನಿರ್ಲವಣೀಕರಣಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.
ನೀರು/0.05% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ (ದ್ರಾವಕ A) ಮತ್ತು 80% ಅಸಿಟೋನೈಟ್ರೈಲ್/0.045% ಫಾರ್ಮಿಕ್ ಆಮ್ಲ (ದ್ರಾವಕ B) ಯ ಕೆಳಗಿನ ಇಳಿಜಾರುಗಳನ್ನು 300 nL/min ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ ಟ್ರಿಪ್ಟಿಕ್ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ: 4% B 5 ನಿಮಿಷಗಳು, ನಂತರ 30 A ರೇಖೀಯ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 45% B ಗೆ, ಮತ್ತು 5 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ 95% ದ್ರಾವಕ B ಗೆ ರೇಖೀಯ ಹೆಚ್ಚಳ.ಕ್ರೊಮ್ಯಾಟೊಗ್ರಾಫಿಕ್ ಕಾಲಮ್ ಅನ್ನು ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ನ್ಯಾನೊ-ಎಮಿಟರ್‌ಗೆ (ಪ್ರೊಕ್ಸಿಯಾನ್) ಸಂಪರ್ಕಿಸಿ, ಮತ್ತು 2,300 V ಯ ಸಂಭಾವ್ಯತೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮಾಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್‌ನ ಬಿಸಿಯಾದ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಗೆ ಎಲುಯೆಂಟ್ ಅನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಸಿಂಪಡಿಸಿ. ಆರ್ಬಿಟ್ರಾಪ್ ಮಾಸ್ ವಿಶ್ಲೇಷಕದಲ್ಲಿ 60,000 ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಸಮೀಕ್ಷೆ ಸ್ಕ್ಯಾನ್ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಕನಿಷ್ಠ ಮೂರು ಡೇಟಾ MS/MS ಸ್ಕ್ಯಾನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ, 30 ಸೆಕೆಂಡುಗಳವರೆಗೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಹೊರಗಿಡಲಾಗಿದೆ, ರೇಖೀಯ ಅಯಾನು ಟ್ರ್ಯಾಪ್ ಘರ್ಷಣೆ ಪ್ರೇರಿತ ವಿಘಟನೆ ಅಥವಾ ಆರ್ಬಿಟ್ರ್ಯಾಪ್ ಪತ್ತೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಹೆಚ್ಚಿನ ಶಕ್ತಿ ಘರ್ಷಣೆ ವಿಘಟನೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ, ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ 7,500 ಆಗಿದೆ.
ಪೋಸ್ಟ್ ಸಮಯ: ಆಗಸ್ಟ್-03-2021